攜帶IL-18基因人臍帶間充質干細胞的構建

王琳，李福年，柳曉義，姜丹丹，呂志棟，曲慧利

(青島大學醫學院附屬醫院乳腺外科，山東 青島 266003)

基因治療是治愈腫瘤的重要舉措之一，大量基礎研究已取得許多重要成果并顯示出良好的應用前景，但如何找到高效性、特異性、靶向性的治療基因載體一直是基礎與臨床研究的熱點。近年來研究顯示，骨髓源性間充質干細胞(MSCs)對腫瘤組織具有趨化特性，能被轉染表達外源基因，同時保持自身生物學穩定性，是一高靶向性基因治療的有效運載工具[1-2]。因骨髓源性MSCs數量有限，增生、分化能力隨著年齡增長而明顯下降，限制了其廣泛應用。相對于骨髓源性MSCs，人臍帶MSCs(hUMSCs)則無上述缺憾。IL-18是新發現的細胞因子，能通過多種途徑發揮抗腫瘤作用[3]。本文擬從人臍帶組織分離hUMSCs，將攜帶IL-18基因的慢病毒轉染該細胞，制備一種能穩定表達IL-18的hUMSCs，為乳癌基因治療提供一種有效的實驗工具。

1 材料和方法

1.1 標本和試劑

臍帶取自我院產科健康剖宮產產婦，經產婦及家屬授權同意；攜帶IL-18基因的慢病毒和攜帶綠色熒光蛋白基因的慢病毒由上海吉瑪制藥技術有限公司構建；RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司；兔抗人IL-18抗體(ab68435)購自美國Abcam公司；抗GAPDH抗體及HRP標記的IgG購自北京康為世紀生物科技公司；小鼠抗人PE或FITC標記的單抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD105購自美國Invitrogen公司；RPMI 1640及DMEM低糖培養基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS)等購自美國HyClone公司。

1.2 方法

1.2.1hUMSCs的體外分離、培養方法和形態學觀察 無菌采集足月健康胎兒臍帶4～5 cm，用磷酸鹽緩沖液(PBS)反復充分洗滌，用注射器沖去臍靜脈及動脈內的殘留血液，分離并去除臍帶外膜組織和血管組織，即可獲得臍帶Wharton膠組織，將其剪碎成1～2 mm3組織塊，移至質量分數為0.001的膠原酶Ⅳ中，37 ℃消化18 h，定時搖動，過100目篩網，收集含細胞的濾液，室溫下以1 200 r/min離心10 min，棄上清液，保留沉淀；用PBS洗滌2次后，以1×109/L的細胞密度接種于T25塑料培養瓶中，置37 ℃、含體積分數0.05 CO2的飽和濕度環境下，于含體積分數為0.10 FBS的DMEM-LG中培養。6～7 d后首次全量換液，棄去未貼壁細胞，以后每3～4 d換液1次。觀察細胞達80%融合后，用胰酶消化1～5 min，在顯微鏡下控制消化時間，按1∶3的比例傳代培養。取生長良好的第3代hUMSCs用于實驗。

1.2.2hUMSCs表面標志的檢測 第3代細胞長到90%融合時，胰酶37 ℃消化1～5 min，調整細胞密度至(1～2)×109/L，使用PBS洗滌3次，加入1 mL預冷的體積分數為0.70的乙醇，充分吹打制成單細胞懸液，4 ℃冰箱中固定24 h后，離心，棄去上清液，分別加入小鼠抗人PE或FITC標記的單抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD105及同型對照，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌后用多聚甲醛重懸，流式細胞儀分析。

1.2.3攜帶IL-18基因的慢病毒轉染hUMSCs 將hUMSCs細胞按每孔1×104接種于96孔培養板中，每孔加100 μL培養基。12～20 h后感染病毒，根據感染復數(MOI)加入相應量的病毒。加polybrene，24 h后換培養液。共設3個組：實驗組轉染慢病毒，對照組轉染空白慢病毒，空白對照組未進行轉染。轉染72 h后熒光顯微鏡下觀察各組綠色熒光蛋白的表達，分析感染效率，選擇最佳感染條件。

1.2.4RT-PCR法檢測IL-18-hUMSCs的mRNA表達 轉染5 d后采用Trizol試劑提取3組細胞總RNA，IL-18基因上游引物序列為：5′-GAATAAAG-ATGGCTGCTGAACC-3′，下游引物為：5′-CCTGG-GACACTTCTCTGAAA-3′，擴增片段長439 bp；以GAPDH作為內參照，擴增片段長146 bp。進行RT-PCR反應，反應條件：95 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，35個循環。取擴增后產物于20 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳分析，與對照組和空白對照組進行比較。

1.2.5Western方法檢測IL-18-hUMSCs的蛋白表達情況 每組收集1×106個細胞，裂解后離心，上清液作為樣本，95 ℃水浴變性10 min，離心，取上清液，-20 ℃冰箱保存。進行SDS-PAGE電泳，電泳完畢后，將蛋白轉移至PVDF膜。封閉后加入兔抗人IL-18抗體(Abcam，1∶1 000)及抗GAPDH抗體，4 ℃反應過夜。第2天洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(北京康為世紀公司生產，1∶8 000)，室溫孵育1 h，化學發光法檢測目的蛋白質的表達水平。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 hUMSCs分離培養和鑒定

體外分離的hUMSCs貼壁生長，呈長梭形，以分散的克隆集落形式增殖(圖1a)。攜帶IL-18基因慢病毒表達載體穩定轉染后，hUMSCs細胞形態未見明顯變化，仍為長梭形(圖1b、c)。流式細胞儀檢測結果顯示，CD29、CD44和CD105為(+)，CD34和CD45為(-)，符合hUMSCs的表型(圖2)。

2.2 轉染IL-18的hUMSCs的鑒定

感染時將病毒按不同MOI值加入hUMSCs細胞中。結果顯示，hUMSCs細胞在MOI為70、50、30、10時的感染率分別為95%、80%、55%、25%(圖3)。MOI值越高，綠色熒光強度越強，MOI為50、30、10時均未見明顯的細胞毒性，但MOI為70時hUMSCs細胞形態欠佳。因此，本研究確定最佳感染條件MOI為50。

2.3 IL-18 mRNA的表達

以GAPDH(長為142 bp)為內參照，實驗組在435 bp處可見一特異性條帶，其IL-18 mRNA的相對表達量為1.38±0.34；而對照組和空白對照組則未見此條帶，其IL-18 mRNA的相對表達量分別為0.48±0.18、0.73±0.29。兩對照組間IL-18 mRNA相對表達量比較差異無顯著性(P>0.05)；與兩對照組比較，實驗組IL-18 mRNA相對表達量明顯增高，差異有顯著性(F=27.54，P<0.05)。見圖4。

2.4 IL-18蛋白表達情況

在轉染后5 d，實驗組中IL-18蛋白的相對表達量為1.46±0.42，而對照組和空白對照組相對表達量分別為0.59±0.25、0.53±0.36。兩對照組間IL-18蛋白相對表達量比較差異無顯著性(P>0.05)；與兩對照組比較，實驗組IL-18蛋白相對表達量明顯增高，差異均有顯著意義(F=31.22，P<0.05)。見圖5。

a：第3代hUMSCs細胞(普通光，100倍)；b：感染5 d時hUMSCs細胞(普通光，200倍)；c：感染5 d時hUMSCs細胞(熒光，200倍)。

圖2 流式細胞儀鑒定人臍帶間充質干細胞表型特征

MOI值：A=70，B=50，C=30，D=10。100倍。

M:標準參照物，①實驗組，②對照組，③空白對照組。

A：GAPDH，B：IL-18。

3 討 論

目前，常用腫瘤的基因治療載體主要有病毒載體和非病毒栽體兩類，病毒性載體的優點是轉染效率高，但受免疫原性、細胞毒作用、攜帶外源基因的大小受限和病毒滴度不易提高等問題困擾，其研究和應用受到一定限制；非病毒性載體的優點就是安全、制備簡單及攜帶外源性基因的容量巨大，但其轉染效率較低、基因表達時間較短也影響其應用[4]。如何建立安全有效的治療基因導入系統成為研究者們首要解決的問題。

MSCs是一種多能干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能，同時具有增殖能力強、向腫瘤遷移等重要的生物學特性，該細胞能被高效轉染并表達外源性目的基因，且不因轉染外源基因而致改變。尤其MSCs的趨化追蹤能力，可使其遷移至無法實施手術切除甚至影像學無法發現的腫瘤轉移灶，通過表達抗腫瘤分子清除轉移灶，進而降低腫瘤復發的概率，特別是對轉移性較強的腫瘤具有重要治療價值，在腫瘤基因治療領域具有廣闊的應用前景[5-6]。目前研究表明，骨髓來源MSCs的應用具有一定局限性，隨著明顯減少的干細胞數量、老化的年齡和下降的增殖分化能力，骨髓量也有提取限制，取材時對病人也有損傷，而且移植給異體有發生免疫反應的風險。更原始、更低的免疫原性使hUMSCs一般不引起免疫反應。其優點還有：從產婦嬰兒身上取材方便且安全性高，沒有道德、倫理學的限制，以及感染及傳播潛伏性病毒和病原微生物概率較低等[7]。

IL-18是一多效性細胞因子，具有誘導γ干擾素產生、增強自然殺傷細胞和毒性T淋巴細胞活性、誘導輔助T細胞等多種生物學功能。它能通過激活T細胞和巨噬細胞來誘導癌細胞凋亡和抑制腫瘤血管生成，并且能與其他因子協同抗腫瘤或直接殺滅腫瘤細胞，發揮強大的抗腫瘤作用[8]。

本研究從人臍帶組織中成功分離出hUMSCs，將攜帶IL-18基因的慢病毒轉染至hUMSCs，構建的IL-18-hUMSCs培養后穩定表達IL-18 mRNA和蛋白，表明hUMSCs作為IL-18的有效運載工具是切實可行的。IL-18-hUMSCs既能發揮MSCs的靶向腫瘤部位的特性，又能發揮IL-18抗腫瘤效應，可作為腫瘤靶向基因治療新選擇。

[參考文獻]

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