Apo-2L對(duì)放射線誘導(dǎo)鼻咽癌CNE細(xì)胞凋亡作用

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(青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003)

凋亡素2配體(Apo-2L)又被稱為腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)抗體(TRAIL)，屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一[1]。研究表明，Apo-2L廣泛表達(dá)于多種組織，通過(guò)與細(xì)胞膜上的死亡受體結(jié)合選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用[2]，成為目前腫瘤生物治療新的研究方向[1]。但是并非所有腫瘤細(xì)胞對(duì)Apo-2L都敏感，有研究顯示，約有60%腫瘤細(xì)胞對(duì)其敏感[3]。另有研究表明，Apo-2L與放化療具有協(xié)同作用[4]。本文研究Apo-2L與放射治療協(xié)同對(duì)體外培養(yǎng)鼻咽癌CNE細(xì)胞增殖周期及凋亡率的影響，以期為臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CNE細(xì)胞株購(gòu)自上海復(fù)祥科技有限公司;重組人Apo-2L購(gòu)自江萊試劑(上海)有限公司;MTT試劑盒及細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清、2.5 g/L胰蛋白酶購(gòu)自Hyclon公司;青鏈霉素混合液、凍存液購(gòu)自Solarbio公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;常溫離心機(jī)由上海醫(yī)用儀器廠生產(chǎn);光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn);吸收光酶標(biāo)儀(ELx808)為美國(guó)Biotek公司生產(chǎn);流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn);醫(yī)用直線加速器(23EX)為美國(guó)Varian公司生產(chǎn)。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) CNE細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)0.10新生牛血清)，在含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，至細(xì)胞融合達(dá)70%時(shí)進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE細(xì)胞，加入2.5 g/L胰酶消化30 s，加入含血清RPMI-1640液3 mL終止消化，并充分吹打細(xì)胞，吹打混勻后，取100 μL進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，配制密度為1×107/L細(xì)胞懸液，接種于平底96孔板， 加入RPMI-1640液梯度稀釋的Apo-2L，最終濃度分別為10、50、100、200、400、800 μg/L。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照孔，置培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)24、48 h，加入5 g/L的 MTT 20 μL，作用4 h后看到藍(lán)色結(jié)晶時(shí)，棄去上清液，加入DMSO 150 μL，輕微震蕩后用酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。參考細(xì)胞生長(zhǎng)抑制≤50%的實(shí)驗(yàn)藥物濃度(IC50)，選擇Apo-2L的最佳實(shí)驗(yàn)藥物濃度。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CNE細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/L，接種于12.5 mm2培養(yǎng)瓶中預(yù)培養(yǎng)24 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨機(jī)分為對(duì)照組(CK組)、Apo-2L組(T組)、Apo-2L+放射組(T+R組)及單純放射組(R組)。培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，T組及T+R組加入最佳實(shí)驗(yàn)藥物濃度的Apo-2L[5]，對(duì)照組及R組加入等量培養(yǎng)液，作用12 h后，T+R組及R組行6 MV X線照射(DT=2.0 Gy，SSD=100 cm，F(xiàn)SZ=10 cm×10 cm，1 cm厚組織補(bǔ)償和反散射膠體[6])，其余兩組只給予擺位而不進(jìn)行照射，照射完畢繼續(xù)培養(yǎng)累計(jì)24 h。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 根據(jù)凋亡檢測(cè)試劑盒方法，收集累計(jì)作用24 h的CNE細(xì)胞，Annexin V-FITC和 PI染色，避光、常溫孵育15 min后于1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒步驟進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Apo-2L對(duì)CNE細(xì)胞增殖的影響

不同濃度Apo-2L作用鼻咽癌CNE細(xì)胞24、48 h，鼻咽癌CNE細(xì)胞抑制率隨著Apo-2L濃度升高而升高，差異有顯著性(F=11.35,P<0.05)，鼻咽癌CNE細(xì)胞的抑制率與Apo-2L的濃度呈正相關(guān)(r=0.91,P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1。根據(jù)不同濃度Apo-2L對(duì)鼻咽癌CNE細(xì)胞抑制率曲線和IC50計(jì)算，并參考MARINI等[5]的方法，實(shí)驗(yàn)最終選擇100 μg/L的Apo-2L作用24 h為凋亡率實(shí)驗(yàn)濃度和作用時(shí)間。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率的比較

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，CK組、T組、R組、R+T組細(xì)胞凋亡率分別為4.027±0.357、6.503±0.517、8.637±0.279、11.213±0.472。各組細(xì)胞凋亡率比較，R組、T組高于CK組，R+T組高于R組、T組，差異有顯著性(F=8.64，P<0.05)。見(jiàn)圖2。

表1 不同濃度Apo-2L分別作用24、48 h鼻咽癌CNE細(xì)胞抑制率

圖1 不同濃度Apo-2L作用24、48 h的鼻咽癌CNE細(xì)胞抑制率對(duì)數(shù)曲線

圖2 各組鼻咽癌CNE細(xì)胞培養(yǎng)24 h凋亡情況

2.3 各組細(xì)胞周期分布比較

CK組和R+T組G0-G1期細(xì)胞比率高于其他兩組，差異有顯著性(F=16.23,P<0.05)；S期各組間比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)；R+T組G2-M期細(xì)胞比率較其他各組降低，差異有顯著意義(F=7.74,P<0.05)；其余各組各期細(xì)胞分布差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞周期分布比較

3 討 論

鼻咽癌主要發(fā)生于黃種人，亞洲及南太平洋國(guó)家和地區(qū)多發(fā)，也是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。 近年來(lái)研究認(rèn)為，EB病毒與鼻咽癌的關(guān)系密切。病理檢查顯示，鼻咽癌多為低分化鱗癌，因靶區(qū)深在而廣泛，手術(shù)的毀損性大，公認(rèn)的首選治療方法為放射治療，但僅早期病人的治療效果滿意；化學(xué)治療對(duì)療效提高起到一定作用，中醫(yī)中藥及免疫治療等對(duì)療效的提高作用有限。

Apo-2L廣泛表達(dá)于多種人體正常組織，通過(guò)與細(xì)胞膜上的死亡受體結(jié)合選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用[2]；有研究結(jié)果表明，Apo-2L與放化療具有協(xié)同作用[4]。目前，已發(fā)現(xiàn)5種特異性Apo-2L受體，即死亡受體(DR)中的DR4(TRAIL-1)、DR5(TRAIL-2)，誘騙受體(DcR)中的DcR1(TRAIL-3)、DcR2(TRAIL-4)，以及抑骨素(OPG)。DR4、DR5與Apo-2L受體特異性結(jié)合后，通過(guò)激活Caspase蛋白酶解級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；DcR1、DcR2與Apo-2L結(jié)合后不能轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)，但可與DR4、DR5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Apo-2L受體，從而抑制Apo-2L介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Apo-2L受體在人體正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞中存在表達(dá)特異性，正常細(xì)胞常同時(shí)表達(dá)DR和DcR，而腫瘤細(xì)胞中DcR常不表達(dá)，這一差異可能是Apo-2L能夠選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的原因[7]。

Apo-2L誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用是通過(guò)與細(xì)胞膜上的DR4、DR5結(jié)合后啟動(dòng)的，通過(guò)FADD途徑激活Caspase從而啟動(dòng)線粒體依賴和線粒體非依賴兩種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。另外，Apo-2L還可以通過(guò)TRADD途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。目前研究認(rèn)為，NF-κB主要參與拮抗Apo-2L的凋亡作用[8]。盡管Apo-2L能夠選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但也面臨耐藥問(wèn)題，其耐藥機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)多種促凋亡因子和抗凋亡因子作用有關(guān)，幾乎涉及凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)各個(gè)途徑。但是并非所有腫瘤細(xì)胞對(duì)Apo-2L都敏感，有研究顯示，約有60%腫瘤細(xì)胞對(duì)其敏感[3]。本文的研究結(jié)果表明，Apo-2L能提高鼻咽癌CNE細(xì)胞凋亡率，而且與劑量正相關(guān)；IC50計(jì)算結(jié)果顯示，濃度100 μg/L的Apo-2L為鼻咽癌CNE細(xì)胞的最佳作用濃度；細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示， 100 μg/L的Apo-2L作用24 h后R+T組凋亡率高于CK組、T組、R組，差異有顯著性；R+T組G2-M期細(xì)胞比率低于其他3組，差異有顯著性。說(shuō)明體外放療聯(lián)合Apo-2L能夠作用于鼻咽癌CNE細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞周期同步化分布，對(duì)分次放療有潛協(xié)同作用。

放射治療可通過(guò)直接或間接引起DNA損傷，激活一系列基因、因子或蛋白最終引起細(xì)胞凋亡[9]。有研究顯示，放射線能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)Apo-2L的敏感性，二者具有交叉增敏作用[10]。其機(jī)制可能為：①通過(guò)上調(diào)死亡受體DR4、DR5的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)Apo-2L敏感性[10]；②通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)從而調(diào)節(jié)線粒體依賴的細(xì)胞凋亡；③通過(guò)增強(qiáng)Caspase瀑布式級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)而引起細(xì)胞凋亡[11]，這種協(xié)同作用是P53依賴性的[5]。

在鼻咽癌治療中，放射治療的效果與放射線劑量呈正相關(guān)，由于放射野內(nèi)要害器官的限制，使得放射治療的照射劑量受限，中、晚期病人往往很難達(dá)到滿意療效。Apo-2L對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性的凋亡誘導(dǎo)作用，理論上與放射線協(xié)同可能增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞周期同步化，與分次放療相配合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞殺傷和縮小靶區(qū)體積。如果加大腫瘤細(xì)胞殺滅同時(shí)，適度降低放射劑量，可以減少射野內(nèi)要害器官的照射損傷，對(duì)正常組織起到保護(hù)作用。

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