TLR2和TLR4在乳癌組織表達及臨床意義

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(青島大學醫學院，山東 青島 266021 1 生物化學與分子生物學教研室； 2 微生物學教研室； 3 附屬醫院乳腺外科； 4 2010級七年制臨床醫學專業)

乳癌是全球性的女性常見惡性腫瘤之一,嚴重威脅著婦女的健康，在中國許多大中城市，乳癌已躍居女性惡性腫瘤的第一位[1]。該腫瘤隱匿期長，早期發現及早治療非常重要。近年來在乳癌的發病機制研究方面取得了一定進展，但對其早期診斷和臨床治療并沒有實質性突破。Toll 樣受體(TLRs)是新近發現的參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLRs可以營造炎癥微環境導致腫瘤形成，并在腫瘤形成基礎上促進腫瘤進展。研究結果顯示，TLRs不僅在免疫系統細胞表達，也廣泛表達于腫瘤細胞[2-3]。在腫瘤發生發展中 TLRs 信號有重要作用。TLR2 和TLR4 在乳癌組織表達及其在腫瘤發生發展中的作用尚未明了，本研究通過檢測乳癌組織中TLR2 和TLR4 的表達，探討其與乳癌發生發展的關系，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源

隨機收集青島市中心醫院和青島大學醫學院附屬醫院2010年7月—2012年3月收治，經病理組織學確診的乳癌病人的新鮮癌組織及相應癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)213例。所有病人均為女性，年齡32～80歲，中位年齡54.3歲。病理類型：浸潤性非特殊型癌209例(其中浸潤性導管癌198例，浸潤性小葉癌4例，髓樣癌5例，基底細胞樣癌2例)，浸潤性特殊型癌4例(均為乳頭狀癌)。應用國際抗癌聯盟的TNM分期法分期：T1期98例，T2期115例；N0期122例，N1期45例，N2期33例，N3期13例；M0期213例。所有病人術前均未接受過新輔助化療、內分泌治療及放射治療，并除外雙側原發乳癌和合并其他惡性腫瘤病人。

1.2 主要試劑

HotstarTaq DNA聚合酶由大連TaKaRa公司提

供；逆轉錄(RT)試劑盒購自立陶宛MBI Fermentas公司擴增；引物由南京金思瑞生物工程技術服務有限公司合成；QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國QIAGEN公司。

1.3 RNA提取與純化

采用TRIzol一步法提取組織總RNA，具體步驟按照說明書進行操作。滅活所提取的RNA樣品中混雜的DNA并純化RNA樣品。

1.4 TLR2和TLR4 mRNA檢測

1.4.1RT-PCR ①引物設計：TLR2和TLR4及內參照基因GAPDH引物序列見表1。②cDNA的合成：采用RT試劑盒進行cDNA合成，具體操作步驟按說明書進行。RT完成后，cDNA樣本于-80 ℃保存備用。③PCR擴增：用上述合成的cDNA作模板進行TLR2和TLR4擴增，內參照GAPDH擴增的上下游引物各0.4 μmol/L(1.0 μL)，其他反應體系與條件同前。并用ddH2O作為空白對照。

1.4.2PCR擴增產物檢測 將PCR擴增產物于含有0.5 mg/L溴化乙錠的15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統記錄并分析電泳結果。

表1 TLRs和GAPDH RT-PCR引物

1.4.3Real-time PCR檢測 以上述合成的cDNA為模板，按照QuantiFast SYBR Green PCR Kit試劑盒說明進行Real-time PCR反應，從上述213例乳癌組織及其癌旁組織中隨機抽取30例對TLR2和TLR4基因的mRNA表達量進行定量分析比較。以GAPDH基因作為內參照，每份RNA樣品均進行3次重復檢測，取其平均Ct值用于分析。擴增引物由南京金斯瑞生物工程技術服務有限公司設計合成，引物序列及產物大小同1.4.1。根據所得Ct值，應用2-△△Ct法計算乳癌組織及其相應癌旁組織中TLR2和TLR4相對表達量，每次實驗均重復3次。

1.5 統計學分析

2 結 果

2.1 TLR2與TLR4 mRNA的表達

2.1.1TLR2 mRNA的陽性表達 部分乳癌及其相應癌旁組織TLR2 mRNA RT-PCR檢測的電泳結果見圖1，TLR2基因擴增條帶長度為264 bp，內參照基因GAPDH擴增條帶長度為469 bp。乳癌組織及其相應癌旁組織TLR2的陽性表達率分別為92.49%(197/213)和71.3%(152/213)，乳癌組織TLR2陽性表達率明顯高于其相應癌旁組織，差異有顯著意義(χ2=32.10，P<0.01)。

2.1.2TLR4 mRNA的陽性表達 部分乳癌及其相應癌旁組織TLR4 mRNA RT-PCR檢測的電泳結果見圖2，TLR4基因擴增條帶長度為510 bp，內參照基因GAPDH擴增條帶長度為469 bp。乳癌組織及其相應癌旁組織TLR4的陽性表達率分別為95.78%(204/213)和41.78%(89/213)，乳癌組織TLR4陽性表達率明顯高于其相應癌旁組織，差異有顯著意義(χ2=144.57，P<0.01)。

A：乳癌組織；B：癌旁組織；M：DL2000 DNA Marker；①陰性質控；②～乳癌組織及癌旁組織。

圖1RT-PCR檢測部分標本TLR2mRNA表達

A：乳癌組織；B：癌旁組織；M：DL2000 DNA Marker；①陰性質控；②～乳癌組織及癌旁組織。

圖2RT-PCR檢測部分標本TLR4mRNA表達

2.2 乳癌組織TLRs表達與臨床病理因素關系

乳癌組織中TLR2和TLR4 mRNA表達與腫瘤的組織學分級以及雌激素受體(ER)陽性表達、孕激素受體(PR)陽性表達均有關(χ2=4.06～30.86，P<0.05)，而TLR2 mRNA表達與抑癌基因p53的表達也有關(χ2=5.71，P<0.05)。見表2。

表2 乳癌組織TLRs表達與臨床病理因素關系(例(χ/%))

2.3 Real-time PCR檢測TLRs mRNA表達水平

乳癌組織和癌旁組織中TLR2 mRNA相對表達量分別為0.79±0.10、0.65±0.15，TLR4 mRNA相對表達量分別為0.81±0.12、0.67±0.16。乳癌組織TLR2和TLR4 mRNA表達量顯著高于其相應癌旁組織(t=4.26、3.89，P<0.05)。

3 討 論

TLRs廣泛分布于免疫細胞尤其非特異免疫細胞或細胞器膜的表面，是進化過程中比較保守的一個受體家族，是感受病原體入侵的主要受體之一[4]。很多研究顯示，腫瘤發展與慢性炎癥密切相關，多種腫瘤的生物學行為與介導炎癥的TLRs密切相關。TLRs在不同的腫瘤細胞表達有差異，并且在腫瘤的發生、發展、耐藥和侵襲過程中發揮重要作用。目前已發現的TLRs家族至少包括12個成員，不同的TLRs其配體也有所不同。

TLR2識別譜較廣，可識別大部分已發現的病原體相關分子模式(PAMP)結構，其不僅是機體介導天然免疫反應的重要分子，而且在組織修復的過程中也發揮著重要作用。研究認為，在腫瘤發生前，TLR2信號途徑的持續激活是慢性炎癥持續存在進而發展為惡性腫瘤的重要原因[5]。近年來研究顯示，TLR2在很多腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達上調，尤其是上皮來源的腫瘤。但乳癌組織中TLR2的表達情況尚不清楚。本研究結果顯示，乳癌組織TLR2的表達明顯上調，其在N3期(淋巴結轉移)的表達比N0期有較明顯的增高趨勢，說明TLR2在一定程度上促進了癌細胞的增殖，參與乳癌的轉移，提示TLR2可能通過激活TLRs信號通路參與乳癌的惡性進程，進而影響病人預后；而腫瘤的組織學分級越高，TLR2的表達率越高，提示TLR2有可能成為腫瘤分化不良的重要標志。YANG等[6]對黑色素瘤研究顯示，腫瘤細胞釋放的HSP60持續激活TLR2通路，進而激活信號轉導和轉錄激活因子，導致免疫抑制細胞因子和趨化因子釋放，促進黑色素瘤細胞的增殖和浸潤，而針對TLR2的治療能顯著降低肺部的轉移，增加荷瘤鼠的存活。我們推測，乳癌與其他腫瘤一樣，在腫瘤微環境內可能也存在著TLR2內源性配體，激活乳癌細胞TLR2信號通路，從而引起局部炎癥樣反應，并通過上述類似的機制促進癌細胞的增殖、凋亡抵抗等。因此，TLR2有望成為乳癌預后判斷指標和新的治療靶點。

TLR4普遍表達于多種腫瘤細胞，腫瘤的發展與TLR4參與激活的信號通路有密切關系。近年研究顯示，TLR4在很多腫瘤細胞系和腫瘤組織中表達上調。它表達于多種腫瘤細胞中，如人頭頸鱗狀細胞癌[7]、結直腸癌[8]、胃癌[9]、卵巢癌[10]、宮頸癌[11]、肺癌[12]、前列腺癌、黑色素瘤[13]、乳癌[14]、胰腺癌等。TLR4在乳癌組織中的表達尚少見報道。本研究結果顯示，乳癌組織TLR4表達明顯上調，其表達與腫瘤的組織學分級、T分期和ER、PR的狀態均有關。腫瘤的組織學分級越高，TLR4的表達率越高，TLR4可能參與了腫瘤的惡性進程，有可能成為腫瘤分化不良的重要標志，提示TLR4可能通過激活TLRs信號通路參與乳癌的惡性進程，進而影響病人預后。T2期TLR4的表達顯著高于T1期，說明TLR4可能促進腫瘤細胞的增殖，影響腫瘤的發展進程；ER陽性組TLR4的表達顯著高于ER陰性組；與PR陰性組比較，PR陽性組中TLR4的表達也有顯著增高。乳癌是一種雌激素依賴性腫瘤，研究表明，ER、PR與乳癌的組織分化和預后有密切聯系，ER、PR陽性往往預示著病人預后較好，而本研究中ER、PR陽性乳癌組織中TLR2和TLR4的表達明顯升高，與預期結果不符，這可能與我們收集的乳癌標本中ER、PR陰性例數太少有關，在后期的研究中需擴大標本例數做進一步研究。TLRs是近年來腫瘤免疫學的研究熱點。其促進腫瘤發生、侵襲轉移、復發、免疫逃逸的分子機制尚待進一步深入研究。TLRs在乳癌發生發展中作用的研究尚少見報道，國內幾乎未見相關研究報道。

總之，本研究TLR2和TLR4在乳癌組織的表達結果提示，TLRs在乳癌的發生發展中發揮重要作用，可能通過激活TLRs信號通路參與乳癌的進程。TLR2和TLR4有望成為乳癌的預后判斷指標和新的治療靶點。對TLRs信號通路的分子機制進行深入研究，將為腫瘤生物治療提供新的策略，從而提高病人生存期和改善預后。

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