乳房浸潤性導管癌組織miR-10b和miR-195表達及意義

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(青島大學醫(yī)學院,山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院乳腺外科； 2 生物化學與分子生物學教研室)

乳癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，我國乳癌的發(fā)病率在近20年呈逐漸上升趨勢，尤其在京、津、滬等大城市，乳癌已位居女性惡性腫瘤發(fā)病率之首，嚴重危害女性健康[1]。micro RNAs(miRNAs)是一類由22個氨基酸組成、高度保守的單鏈非編碼RNA， 廣泛存在于真核細胞生物中，具有轉錄后基因調控功能。成熟的miRNAs通過堿基互補配對的方式與靶mRNA的編碼序列(CDS)或3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結合，引起靶mRNA 的翻譯抑制或切割降解。miRNAs 具有多種生物學功能，在細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡過程發(fā)揮調控作用[2-4]。研究顯示, miRNA 10b(miR-10b)、miRNA 195(miR-195)在多種腫瘤細胞中表達均下調，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。本文通過研究miR-10b、miR-195在乳 癌組織中的表達及其與乳癌臨床病理特征之間的關系，探討miR-10b、miR-195在乳癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本及其來源

乳癌及癌旁組織(距腫瘤邊緣≥5 cm)標本40例，取自我院2013年1—6月期間手術病人，均為女性，年齡28～77歲，中位年齡49.6歲。經術后病理檢查診斷為浸潤性導管癌。所有病人術前未接受放療、化療及內分泌治療。

1.2 實驗試劑及引物

RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)及SYBR熒光定量試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)均由寶生物工程(大連)有限公司提供，逆轉錄試劑盒(BioRT Two Step RT-PCR Kit)購自博日科技有限公司。引物根據miRBASE數據庫設計，以U6作為內參，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各引物序列

注：a通用正向引物，b莖環(huán)引物，c正向引物，d反向引物。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1TRIzol法提取總RNA 按Total RNA 提取試劑所示步驟提取組織中的總RNA，用紫外線分光光度計檢測總RNA濃度及其波長在260 nm和280 nm處吸光度(A)值，所得A260/280值均在1.8～2.0之間。

1.3.2miR-10b、miR-195表達檢測 采用實時熒光RT-PCR 方法。參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ及BioRT Two Step RT-PCR Kit說明書進行逆轉錄及PCR反應，反應體系均為10 μL。逆轉錄反應條件為：55 ℃ 45 min，95 ℃ 5 min，4 ℃ 5 min；PCR反應條件為：94 ℃預變性10 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)。以U6為內參基因,對目的基因進行均一化處理,根據熒光閾值(CT值)計算miR-10b、miR-195相對表達量，計算公式為2-△△CT。其中△CT=CT目標miRNA-CTU6，△△CT=△CT癌組織-△CT癌旁組織。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數據間比較采用t檢驗，相關性分析采用Mann-Whitney U檢驗。

2 結 果

2.1 乳癌及癌旁組織miR-10b、miR-195表達比較

癌旁組織中miR-10b及miR-195的表達量為1.00,miR-10b、miR-195在乳癌組織中的相對表達量分別為0.35±0.40、0.44±0.46，乳癌組織與癌旁組織miR-10b、miR-195表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.35、5.71，P<0.05)。

2.2 乳癌組織miR-10b、miR-195表達與臨床病理特征之間的關系

腫瘤直徑>5 cm的乳癌組織中miR-195表達較直徑≤5 cm者低，有淋巴結轉移及間質脈管癌栓的乳癌組織中miR-195表達明顯低于無淋巴結轉移、無間質脈管癌栓的乳癌組織，差異均有顯著意義(U=-2.127～-2.083，P<0.05)；miR-10b表達與腫瘤大小、淋巴結轉移及間質脈管癌栓等均無相關性(P>0.05)。miR-10b、miR-195表達與腫瘤TNM分期、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)及人表皮生長因子受體-2(Her-2)水平均無明顯相關性(P>0.05)。見表2。

表2 miR-10b、miR-195表達與乳癌臨床病理特征的關系

3 討 論

2002年，CALIN等[5]首次報道m(xù)iRNAs表達異常與腫瘤相關，之后，眾多研究小組在多種人類腫瘤組織中檢測到miRNA異常表達。這些異常表達的miRNAs作用類似于癌基因或抑癌基因，如miRNA155作為癌基因，在一些淋巴瘤亞型中過度表達；而miRNA143和miRNA145作為抑癌基因在結、直腸癌的表達水平下降[6]。與乳癌相關的miRNAs目前也有報道。IORIO等[7]通過對10例正常乳房組織和76例乳癌組織miRNAs的表達水平進行比較，證實miR-125b、miR-145、miR-155和miR-21在乳癌中表達顯著下調，其中miR-155降低程度尤為明顯，miRNAs的表達水平與乳癌的病理生理學特征相關，如病理學分期、增殖指數、ER/PR表達[8]及血管受侵等。TAVAZOIE等[9]研究了一系列與乳癌轉移密切相關的miRNAs，其中miR-335、miR-206與miR-126對腫瘤轉移的抑制發(fā)揮著關鍵性作用。miR-195位于染色體17p13.1，屬于miR-15/16/195家族，該家族與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。早期研究結果顯示，miR-195在肥大心肌細胞中過度表達，可致轉基因小鼠病理性心臟生長及心力衰竭。近期研究顯示，miR-195在多種腫瘤組織表達下調，包括胃癌[10]、肝癌[11]、膀胱癌[12]等。LI等[13]應用miR-195轉染MCF7及ZR-75-30細胞系，結果顯示miR-195高表達可顯著抑制細胞集落形成，誘導細胞G1期阻滯。已有研究顯示，原癌基因絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(Raf-1)亦是miR-195的作用靶點，引入miR-195則可以抑制Raf-1的表達[14]。Raf-1在MAPK/ERK信號轉導通路中發(fā)揮作用，活化的Raf-1能夠調節(jié)細胞周期、細胞遷移、凋亡及分化。本實驗結果顯示，miR-195在乳癌組織中表達明顯下調，其表達水平與腫瘤大小、淋巴結轉移及脈管癌栓侵犯有關，與腫瘤TNM分期、ER、PR及Her-2水平無明顯相關性。提高miR-195可能對腫瘤的生長、浸潤、轉移起抑制作用。

有研究顯示,miR-10b能夠促進腫瘤細胞侵襲及轉移，其在轉移性乳癌中表達增高[15]。此外，非浸潤性乳癌組織中miR-10b表達上調可致腫瘤侵襲和轉移能力顯著增強。Twist是一種凋亡抑制蛋白，它可以與miR-10b啟動子區(qū)結合并誘導其表達，造成促轉移基因(RHOC)表達增加，從而引起腫瘤的侵襲及轉移[16]。本文研究結果顯示，miR-10b在癌組織中表達下調，其表達水平與腫瘤大小、有無脈管癌栓、TNM分期及ER、PR、Her-2水平等均無明顯相關性。說明miR-10b可能主要在腫瘤進展晚期發(fā)生遠處轉移的階段發(fā)揮作用。

綜上所述，miR-10b及miR-195在乳癌組織中表達明顯下調，可能在乳癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用，可作為篩查和診斷乳腺腫瘤的潛在生物學指標。

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