介入化療前后宮頸癌組織pS53及pS642表達及意義

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(1 青島大學附屬醫院婦科，山東 青島 266003； 2 青島市市北區人民醫院檢驗科)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，主要治療方法是手術、放療及化療。化療主要用于中晚期病人，近年來術前新輔助化療(動脈栓塞化療)廣泛應用于臨床，提高了手術切除率，改善了預后。細胞有絲分裂抑制酶Wee1是細胞周期調控的一種關鍵激酶，與腫瘤的發生相關。Wee1第53及642位點絲氨酸磷酸化蛋白(pS53、pS642)在Wee1的失活與激活過程中起重要作用。本實驗采用免疫組織化學法檢測動脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642的表達，研究兩種蛋白的表達變化及其與臨床治療效果的相關性，并探討動脈栓塞化療對細胞周期調控的影響，以期為判定動脈栓塞化療的療效 提供客觀的依據。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

所有標本均取自2009年6月—2012年10月我院活檢或手術切除的宮頸組織蠟塊。其中宮頸癌病人50例，正常宮頸病人40例。病理檢查前未進行放射等治療。宮頸癌病人年齡36～68歲，中位年齡45.3歲。所取得標本均經病理檢查確診為宮頸癌，且均為鱗癌。病人經動脈栓塞化療2～3周后行廣泛性子宮切除加盆腔淋巴結清掃術，按2009年國際婦產科聯盟(FIGO)分期：ⅠB期25例，ⅡA期15例，ⅡB期10例。按組織分化程度分類：高分化15例，中分化30例，低分化5例。正常宮頸病人年 齡40～65歲，中位年齡46.4歲。標本來源于宮頸活檢及子宮肌瘤、子宮腺肌病等子宮良性病變行子宮切除的宮頸組織。兩組病人年齡比較差異無顯著性(P>0.05)。

1.2 試劑

兔抗人pS53蛋白多克隆抗體、兔抗人pS642蛋白單克隆抗體、即用型快捷免疫組織化學MaxvisionTM2試劑盒(鼠-兔)二抗及液體DAB酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 免疫組化方法檢測

將蠟塊置于石蠟切片機，連續4 μm厚切片，制成標本后進行免疫組化染色。切片依次行脫蠟水化、抗原修復、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復染、脫水及中性樹膠封片。

1.4 結果判斷

pS53蛋白主要定位于細胞核中，偶爾在細胞漿中有少量染色；pS642蛋白主要定位于細胞漿中，細胞核中亦可有少量染色。切片染色后，在高倍視野下，隨機選取5個視野計算陽性細胞率。其陽性結果判斷參照SINICROPE等[1]的半定量積分法。以陽性細胞率≤5%為1分，6%～25%為2分，26%～50%為3分，51%～75%為4分，>75%為5分；染色無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細胞率評分與染色強度評分乘積≥3分為陽性。

2 結 果

2.1 正常宮頸組織、動脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642的表達

正常宮頸組織中pS53及pS642陽性表達率分別為15%(6/40)、40%(16/40)，動脈栓塞化療前宮頸癌組織中兩者陽性表達率分別為84%(42/50)、92%(46/50)，組間比較差異有顯著性(χ2=42.50、28.10，P<0.01)。動脈栓塞化療后宮頸癌組織中pS53及pS642陽性表達率為44%(22/50)和52%(26/50)，較動脈栓塞化療前明顯下降，差異有顯著性(χ2=17.36、19.84，P<0.01)。不同臨床分期、組織分化程度動脈栓塞化療前后宮頸癌組織pS53、pS642表達差異無顯著性(P>0.05)。見表1。

2.2 動脈栓塞化療前后宮頸癌組織中pS53及pS642表達變化與臨床療效的關系

動脈栓塞化療后pS53上升者3例，有效率為0；pS53無變化者25例，有效率為88%；pS53下降者22例，有效率為100%。pS642上升者2例，有效率為0；pS642無變化者15例，有效率為73.3%；pS642下降33例，有效率為100%。pS53及pS642在動脈栓塞化療前后表達變化與臨床療效呈負相關，差異有顯著性(r=-0.328、-0.456，P<0.01)。

表1介入化療前后宮頸癌組織pS53、pS642表達與臨床病理特征關系(例)

臨床病理特征npS53化療前化療后pS642化療前化療后臨床分期5042224626 ⅠB期2520122215 ⅡA期15137147 ⅡB期1093104組織分化 高分化15117128 中分化3026132916 低分化55252

3 討 論

3.1 Wee1的表達及意義

Wee1蛋白激酶是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族的一員[2]。Cdc2作為細胞進入有絲分裂的關鍵調節因子，其第15位上的酪氨酸可被Wee1磷酸化，而使Cdc2-CyclinB復合物失活[3]，使細胞停滯在細胞間期進行檢測和修復。隨后，細胞進入G2/M期，Wee1降解，細胞通過G2/M期的檢測點，完成增殖。在細胞增殖的過程中，如果Wee1表達出現異常，細胞或于間期停滯而凋亡，或變異后通過G2/M期檢測而發生癌變。Wee1一方面可通過磷酸化Cdc2阻止異常有絲分裂發生，另一方面其自身的某些位點也可發生磷酸化，調節細胞增殖過程。例如Wee1的絲氨酸第642位點(Ser642)發生磷酸化后與14-3-3蛋白結合，能促使Wee1活化，維持Cdc2-CyclinB復合物失活，使細胞在間期進行檢測和修復。KATAYAMAK等[4]通過實驗證明，將Ser642位點的絲氨酸突變為丙氨酸后，Wee1的Ser642位點不能被磷酸化，而14-3-3蛋白主要通過磷酸化依賴的方式與靶蛋白結合來發揮調控作用，Wee1失去與14-3-3蛋白結合的能力，從而使Wee1失活，細胞增殖發生異常。這說明與14-3-3蛋白的結合需要Wee1 Ser642位點磷酸化，進而說明Wee1的磷酸化活性調節位點位于Ser642。

Wee1蛋白激酶在M期的降解是泛素依賴的降解，它的泛素化連接酶是β-TrCP-containing SCF復合物。Wee1的Ser53能夠與β-TrCP復合物特異性結合并發生磷酸化，從而使Wee1發生降解[5]。Wee1的降解在Cdc2激活中起重要作用[6]，而Cdc2

的激活是恢復因檢查修復DNA損傷點而停止的細胞周期所必需的。因此，Wee1的Ser53位點磷酸化對于細胞增殖順利進行起重要作用。

3.2 pS53及pS642的表達在宮頸癌動脈栓塞化療中的意義

本研究通過免疫組化染色方法檢測顯示，pS53及pS642兩種蛋白均在宮頸癌組織中高表達，在正常宮頸組織中低表達，而且其表達的變化與動脈栓塞化療的效果呈負相關。Wee1調控細胞通過G2/M期檢測點。當DNA復制異常時，Wee1可以阻止有絲分裂繼續進行，DNA完全修復后重新啟動有絲分裂，以保持DNA的完整性。pS53及pS642在Wee1的活化與降解中起巨大作用。順鉑屬細胞周期非特異性細胞毒性藥物，在細胞內可迅速解離，以水合陽離子的形式與細胞內DNA結合形成鏈間、鏈內或蛋白質DNA交鏈，從而破壞DNA的結構和功能。博來霉素抑制胸腺嘧啶核苷嵌入DNA，引起DNA單鏈和雙鏈斷裂，作用于增殖細胞周期的S期。在動脈栓塞化療后pS53及pS642的表達明顯受到抑制，從而推測其與在細胞周期中化療藥物引起DNA的破壞、影響Wee1的穩定性有關。Wee1降解異常，從而細胞越過DNA復制檢測點進入有絲分裂期，進行異常增殖。

有研究顯示，在某些癌組織中Wee1的表達高于其在正常組織中的表達[7]。本研究結果提示，動脈栓塞化療的有效性和pS53、pS642的表達相關，但Wee1和pS53、pS642在動脈栓塞化療過程中的具體作用機制尚需要進一步研究。目前對于細胞增殖的研究表明，Wee1抑制劑能抑制宮頸癌細胞株HeLa細胞的增殖，因此，我們可利用其在細胞周期中G1期的缺陷[8]，運用siRNA轉染法將Wee1抑制劑作用于腫瘤細胞，可抑制腫瘤細胞的生長和增殖。因此，Wee1抑制劑可作為抗腫瘤的分子藥物。研究顯示，Wee1抑制劑還可協同其他抗腫瘤藥物共同發揮作用。例如通過siRNA轉染法將Wee1抑制劑作用于腫瘤細胞后，Wee1失活，這時腫瘤細胞更容易被其他化療藥物，例如多柔比星殺死，同時正常細胞損傷不明顯。Wee1抑制劑(如MK-1775)亦可單一或與吉西他濱、卡鉑、順鉑等化療藥物合用治療進展期的實體腫瘤。因此，我們可以期待在不久的將來，臨床上與Wee1及pS53、pS642相關藥物的廣泛應用能夠為宮頸癌病人的治療提供更多、更好的手段。

[參考文獻]

[1]SINICROPE F A, RUAN S B, CLERAY K Y, et al. Bc12 and P53 oncoprotein expression during colorectal tumorigenesis[J]. Cancer Res, 1995,55:237-241.

[2]OH J S, SUSOR A, CONTI M. Protein tyrosine kinase Wee1B is essential for metaphase Ⅱ exit in mouse oocytes[J]. Science, 2011,332(6028):462-465.

[3]NAKAJIMA H, YONEMURA S, MURATA M, et al. Mytl protein kinase is essential foe Golgi and ER assembly during mitoticexit[J]. J Cell Biol, 2008,181(1):89-103.

[4]KATAYAMA K, FUJITA N, TSURUO T. Akt/protein kinase B-dependent phosphorylation and inactivation of WEE1Hu promote cell cycle progression at G2/M transition[J]. Mol Cell Biol, 2005,25:5725-5737.

[5]WATANABE N, ARAI H, NISHIHARA Y, et al. M-phase kinases induce phosphodependent ubiquitination of somatic Weel by SCFbeta-TrCP [J]. ProcNatl Acad Sci USA, 2004,101(13):4419-4424.

[6]COLEMAN T R, DUNPHY W G. Cdc2 regulatory factors[J]. Current Opinion in Cell Biology, 1994,6(6):877-82.

[7]張金敏,王翔宇,李南,等. PB方案在宮頸癌介入化療中的療效觀察及對 Wee1表達的影響[J]. 現代生物醫學進展, 2014,9:1719-1723.

[8]IORNS E, LORD C J, GRIGORIADIS A, et al. integrated functional, gene expression and genomic analysis for the identifiecation of cancer targets[J]. PLoS One, 2009,4(4):e5120.