肺癌組織CXCR2和CREB的表達及意義

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(1 青島大學醫學院呼吸內科教研室,山東 青島 266021； 2 中國人民解放軍第401醫院呼吸內科)

肺癌是全世界癌癥死亡的首要原因，嚴重威脅人類的健康，而靶向治療為肺癌病人的治療帶來了希望[1]?？鼓[瘤血管生成藥物在腫瘤的治療中發揮重要作用[2]。CXC趨化因子受體2(CXCR2)是一種促血管生成的重要因子，cAMP反應原件結合蛋白(CREB)為細胞核內重要的轉錄因子和反應原件結合蛋白。國外已有研究結果表明，抑制肺癌組織中CREB蛋白的表達后，誘導血管生成的CXC趨化因子及其受體CXCR2的基因表達明顯減少[3]。而國內對肺癌組織中CXCR2和CREB的表達及其關系的研究尚未見報道。本研究應用免疫組化方法，檢測CXCR2和CREB在肺癌組織中的表達，探討二者與肺癌發生、發展的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料

2010年1月—2011年1月，收集中國人民解放軍第401醫院胸外科肺癌手術后石蠟標本49例，所有病人臨床資料完整，術前均未行化療和放療，術后均經病理檢查明確診斷。其中男36例，女13例；年齡33～75歲，中位年齡61歲；吸煙者28例，非吸煙者21例；鱗癌22例，腺癌27例；淋巴結轉移者34例，無淋巴結轉移者15例；中心型25例，周圍型24例；高分化5例，中分化14例，低分化30例。根據1997年國際抗癌聯盟(UICC)肺癌分期標準，Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期23例。另選擇遠離肺癌包塊且無癌細胞浸潤的癌旁正常肺組織(距腫瘤邊緣5 cm以上)20例作為對照。所有標本均行4 μm連續切片。

1.2 CXCR2和CREB表達檢測

采用免疫組織化學Elivision法。使用已知的CXCR2和CREB陽性切片作為陽性對照，PBS液代替一抗作為陰性對照。首先切片脫蠟至水，體積 分數0.03過氧化氫封閉10 min滅活內源性過氧化物酶，微波修復抗原，滴加一抗(兔抗人CXCR2多克隆抗體稀釋比1∶100、兔抗人CREB多克隆抗體稀釋比1∶200)，于4 ℃濕盒過夜，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，然后加DAB顯色，蘇木精對比染色，脫水、封片，顯微鏡下觀察。

1.3 結果判斷

CXCR2陽性表達主要表現為胞膜和(或)胞漿中出現黃色、棕黃色或棕褐色顆粒沉淀；CREB陽性表達主要位于細胞核，少量位于胞漿中，呈黃色、棕黃色或棕褐色顆粒狀。參考文獻標準[4]，根據染色強度陰性、弱陽性、中陽性、強陽性分別計為0、1、2、3分；400倍光鏡下，每張切片隨機選擇10個高倍視野計數陽性細胞，以每100個細胞中含陽性細胞個數作為陽性細胞率，陽性細胞率<10%計為0分，10%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。以陽性細胞率計分與染色強度計分之積作為免疫組化染色的評分，<4分為陰性(-)，4～5分為弱陽性(+)，≥6分為陽性()，分析時將(-)定義為陰性表達，(+)和()定義為陽性表達。

1.4 統計學處理

應用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，數據間比較采用χ2檢驗，應用Spearman方法進行相關分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肺癌組織與癌旁正常組織中CXCR2和CREB的表達比較

CXCR2和CREB在肺癌組織中陽性表達率分別為69.4%(34/49)和57.1%(28/49)，二者在癌旁正常肺組織中的陽性表達率分別為15.0%(3/20)和10.0%(2/20)，CXCR2和CREB在肺癌組織中的表達明顯高于其癌旁正常肺組織，差異均有顯著意義(χ2=14.778、10.998，P<0.05)。

2.2 肺癌組織CXCR2與CREB表達與臨床病理特征的關系(例)

肺癌組織CXCR2和CREB的陽性表達均與腫瘤的分化程度(χ2=4.102、12.042，P<0.05)和腫瘤TNM分期有關(χ2=4.836、7.894，P<0.05)，與肺癌病人的年齡、性別和腫瘤大小、腫瘤位置及淋巴結轉移均無關(P>0.05)。CREB在肺鱗癌組織表達明顯高于腺癌(χ2=13.920，P<0.05)，而CXCR2在肺鱗癌和腺癌組織中表達差異無顯著意義(P>0.05)。CREB在吸煙者中的表達明顯高于非吸煙者(χ2=8.507，P<0.05)，而CXCR2的表達與肺癌病人是否吸煙無明顯相關性(P>0.05)。見表1。

表1肺癌組織CREB和CXCR2表達與臨床病理特征的關系(例)

臨床病理特征nCREB陽性表達χ2PCXCR2陽性表達χ2P年齡(歲) ≤61271619 >6122120.1100.216150.0270.240性別 男362125 女1370.0790.24590.1130.273腫瘤大小(d/cm) ≤ 5291621 >520120.1130.219130.3060.211位置 中心型251518 周圍型24130.1700.209160.1640.224分化程度 高-中分化19516 低分化302312.0420.001104.1020.035TNM分期 Ⅰ+Ⅱ261014 Ⅲ+Ⅳ23187.8940.005204.8360.011淋巴結轉移 陽性342024 陰性1580.1280.229100.0750.250病理類型 鱗癌221914 腺癌27913.9200.000200.6220.180吸煙狀況 吸煙282122 非吸煙2178.5070.004122.5940.070

2.3 肺癌組織中CXCR2與CREB表達之間的相關性

相關分析顯示，肺癌組織中CXCR2與CREB表達呈正相關(r=0.319，P<0.05)。

3 討 論

CXCR2屬于趨化因子受體的一種，可與白細胞介素-8、生長調節癌基因、巨噬細胞炎性蛋白-2和中性粒細胞激活蛋白-2等因子相結合，是促血管生成趨化因子的共同受體，多表達于腫瘤細胞和血管內皮細胞的表面。CXCR2與其配體結合后，通過下游細胞內cAMP-蛋白激酶A(PKA)和Ras/Raf/MEK/JNK/p38等信號轉導通路，以及轉錄因子NF-κB和CREB途徑，作用于酪氨酸激酶受體，引起血管內皮細胞增殖、趨化運動及抑制內皮細胞凋亡等一系列促進血管新生的效應[5]。研究顯示，在多種惡性腫瘤包括胰腺癌[6]、人惡性黑色素瘤[7]和肺癌[8]都有CXCR2的激活，并認為CXCR2可能通過轉錄因子調控細胞增殖、細胞凋亡和血管生成相關基因的表達，參與惡性腫瘤的發生。

CREB是細胞核內重要的轉錄調控因子，由341個氨基酸殘基構成，相對分子質量為43 000，由C端區域和N端區域構成，C端與啟動子結合，N端參與信號分子的調節轉錄。CREB發生磷酸化而活化后，形成同源或異源二聚體，在輔助因子的幫助下，識別并結合目的基因啟動子中的cAMP反應元件(CRE)，促進基因的轉錄表達，參與腫瘤的增殖、分化和轉移[9]。林成招等[10]研究顯示，大豆異黃酮可以抑制大鼠乳癌細胞內磷酸二酯酶的活性，活化cAMP/PKA信號轉導通路，增加癌細胞內cAMP濃度，增強CREB表達。SUN等[3]用特異性阻斷劑抑制A549肺癌細胞株中CREB表達，降低其活性，可減少CXC趨化因子及其受體CXCR2在細胞中的基因表達水平，推測CREB很可能是CXCR2的轉錄調控因子。

本研究結果顯示，肺癌組織中CXCR2和CREB的表達增高，少數癌旁正常肺組織中亦可檢測到CXCR2和CREB的表達，但其表達量明顯低于肺癌組織，與吳勇等[11]報道的結果一致。該現象是否為肺癌早期肺內轉移的跡象和征兆尚不清楚，定期追蹤檢測可能會進一步明確二者在肺癌早期診斷和轉移中的意義。本文研究結果還顯示，肺癌組織中CXCR2和CREB的表達均與腫瘤的TNM分期和分化程度有關，Ⅲ+Ⅳ期肺癌組織中二者的表達明顯高于Ⅰ+Ⅱ期，低分化肺癌組織中二者的表達明顯高于高-中分化，提示CXCR2和CREB在肺癌組織中的陽性表達水平越高，肺癌的惡性程度越高。本研究還顯示，CREB在吸煙病人肺癌組織中的表達明顯高于非吸煙者，在肺鱗癌組織中的表達明顯高于腺癌。吸煙是目前公認的肺癌主要致病因素，而且與肺鱗癌的發生密切相關，推測吸煙可能上調CREB蛋白表達，參與肺癌尤其是肺鱗癌的發生，與SEO等[12]的結果一致。本研究結果顯示，CXCR2和CREB在肺癌組織中表達呈顯著正相關，提示肺癌組織中CREB的活化可能促進了CXCR2的蛋白表達，二者協同作用共同促進肺癌的發生。

綜上所述， CXCR2和CREB陽性表達與肺癌發生有關，對肺癌的發展起重要作用，二者有望成為肺癌治療的靶位點。

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