原發性肝癌患者血管緊張素轉化酶與血管緊張素轉化酶2 基因轉錄水平變化趨勢*

齊明華 劉吉奎 葉 靜 漆正宇 萬匯涓 李明華 余光銀 尹耀新 歐 希

1.北京大學深圳醫院感染性疾病科(廣東 深圳，518036) 2.深圳醫院肝膽外科 3.深圳醫院中心實驗室 4.深圳醫院病理科

原發性肝癌是一種發病率和死亡率都很高的疾病，全世界每年平均約有25 萬人死于肝癌，高居腫瘤死亡人數第5位;原發性肝癌也是我國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在我國消化系統惡性腫瘤中居第3 位，占世界肝癌死亡病例的45%［1］。

研究發現，組織通過自分泌和旁分泌產生的局部腎素-血管緊張素系統(renin angiotensin system，RAS)與癌癥的發生和轉移密切相關。RAS 的ACE-Ang 2-AT1 受體軸和ACE2-AngⅠ-7-Mas 受體軸中，Ang2 為血管緊張素2 (angiotensin 2)，而AngⅠ-7 為血管緊張素1 的降解產物7 肽(angiotensin1-7)。這兩個受體軸都能影響腫瘤增生和轉移，但作用相反。ACE-Ang 2-AT1 受體軸起促進腫瘤增生和轉移的作用，例如，AT1 受體表達與胃癌淋巴結轉移及腫瘤侵襲正相關［2］，而且ACE 抑制劑可以顯著減少小細胞肺癌淋巴結轉移［3］。ACE2-AngⅠ-7-Mas 受體軸則對腫瘤增生和轉移起抑制作用，研究表明，ACE2 在小細胞肺癌和胰腺癌癌巢組織表達下調，使ACE2 基因靜默，可以促進腫瘤細胞增生［4］。用AngⅠ-7 處理肺癌接種模型的體內試驗表明，AngⅠ-7 可以減少肺癌腫瘤細胞增生［5］。

我們通過比較肝癌患者癌組織與癌旁組織ACE、ACE2 及其受體AT1、MAS 基因轉錄水平的差異，初步揭示ACEAng2-AT1 受體軸和ACE2-AngⅠ-7-Mas 受體軸在原發性肝細胞癌中相互制約從而達到平衡的現象。

1 材料與方法

1.1 一般材料 實驗中6 例份肝癌和癌旁標本均為我院2010年和2011年手術切除標本，病理學資料齊全。患者均未接受放化療，臨床資料見表1。

表1 患者的臨床及病理資料

1.2 試劑 Trizol 試劑購自Invitrogen 公司。RT-PCR 試劑盒及SYBRGreen qPCR 試劑盒均購自Fermantas 公司。ACE、ACE2、AT1 及MAS 引物由上海生工公司合成，見表2。

表2 試驗中用到的引物序列

1.3 方法 分別稱取-80℃冰箱保存的12 例配對組織標本各100mg。Trizol 法提取組織總RNA，經酚氯仿抽提純化。用紫外分光光度儀測定A260/A280 值均在1.9～2.0 之間，RNA純度較好。使用Fermantas 公司逆轉錄試劑盒，oligo (dT)為引物，按標準流程合成cDNA。

RT-qPCR 的ΔΔCT 法相對定量ACE、ACE2 及其受體AT1、MAS 基因的轉錄水平。采用Fermantas 熒光定量試劑盒，按標準流程，二步法在ABI Prism 7000 熒光定量PCR 儀上進行qPCR 反應，95℃初步變性10min，95℃變性15s，60℃延伸30s，共30 個循環反應。反應內參為18s RNA。每批實驗均設立陰性對照及陽性對照。

1.4 判定標準 ΔCT 癌巢/ΔCT 癌旁 ＞1 表明癌巢表達較癌旁高，＜1 表明癌巢表達較癌旁低。

2 結果

實驗顯示，相對于癌旁組織，癌巢組織中ACE 與ACE2的基因轉錄水平變化趨勢一致，協同升高或降低;ACE 和AT1 的基因轉錄水平變化一致，協同升高或降低。但ACE2 與其受體MAS 的基因轉錄水平一致性不好，只有E 和F1 兩例病人的癌巢組織/癌旁組織趨勢一致，分別為協同降低，其他病例表達不一致。見圖1 及圖2。

圖1 癌巢組織/癌旁組織ACE 與ACE2的基因轉錄水平變化趨勢一致

圖2 癌巢組織/癌旁組織ACE 與AT1的基因轉錄水平變化趨勢一致

3 討論

以往，人們認為腎素-血管緊張素(RAS)主要作用是調控血壓，調節水鹽平衡。近年來，不論是臨床研究，還是動物試驗，以及體外研究均發現，RAS 在惡性腫瘤中表達失衡，而且與預后密切相關。RAS 的拮抗劑可以抑制腫瘤生長、轉移和血管形成，回顧性臨床研究則發現，長期口服ACE 抑制劑可以預防腫瘤。而且這種作用與RAS 的降壓作用無關［7～11］。

隨后的深入研究主要在對AT1 受體的表達與癌癥的關系方面，研究表明，在乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌和胰腺癌及胃腸道腫瘤中，AT1 的表達均異常，且這種異常源于這些組織原本在正常生理活動中起作用的局部的RAS 組分［11］。

但是，目前原發性肝細胞癌中RAS 組分表達情況的研究尚未見到。本文首次從臨床標本入手，通過自身對照，研究原發性肝細胞癌癌組織和癌旁組織RAS 主要組分的表達情況，為探討RAS 與原發性肝細胞癌發生、生長的關系提供了實驗依據。自體癌組織和癌旁組織對照，較好地平衡了個體間差異。

RAS 復雜的組分中，ACE-Ang 2-AT1 受體軸與ACE2-AngⅠ-7-MAS 受體軸是兩個主要的調控系統，在惡性腫瘤發生、生長和轉移中起到調控作用。本文首次探討了ACE-Ang2-AT1受體軸與ACE2-AngⅠ-7-MAS 受體軸在原發性肝細胞癌中的相互作用規律。實驗結果表明，相對于癌旁組織，癌巢組織中ACE 與ACE2 的基因轉錄水平變化趨勢一致，協同升高或降低;ACE/AT1 的基因轉錄水平變化一致，協同升高或降低，提示原發性肝細胞癌患者中，ACE-Ang 2-AT1 受體軸與ACE2-AngⅠ-7-MAS 受體軸的調控作用是彼此制約，當ACE表達增強時，ACE2 代償性升高，從而達到平衡;而ACE 表達增強的同時，AT1 表達也增強，反之降低，說明ACE 可能是通過AT1 起到調控作用的。

在具體的RAS 組分與腫瘤的關系中，研究最多的是AT1受體同腫瘤發生、增殖、轉移的關系，這方面乳腺癌的研究較深入。有研究顯示，有約占10%～20%的乳腺癌中，AT1表達明顯增高［12，13］，而且，AT1 表達與腫瘤進展過程中不同階段有關，比如在增生及原位癌階段，AT1 在乳腺癌中的表達較高，而在侵襲性階段則降低［14］。

我們首次關注AT1 在原發性肝細胞癌中的基因表達情況，在癌巢中呈高表達的有3 個病例:病例A，D，F;在癌巢中呈低表達的有3 個病例:病例B，C，E，各占50%。高轉錄水平的3 個病例中有1 例出現血管侵犯，2 例無血管侵犯;低表達的3 個病例中，也是有1 例出現血管侵犯，2 例無血管侵犯，差異不明顯。但觀察高轉錄水平病例中，有2 例腫瘤較小，1 例腫瘤較大;低表達病例則是3 例腫瘤較大，似乎AT1轉錄水平與腫瘤生長有關，AT1 轉錄水平低，腫瘤體積大。4例腫瘤大小評分為2 的病例，即B，C，D，E 中，肝內腫瘤的個數在B，E 中為3，AT1 低轉錄水平為100%;C，D 病例中肝內轉移瘤個數為2，AT1 低轉錄水平為50%。提示相同原發癌灶大小的情況下，AT1 轉錄低水平可能更有利于肝內轉移，與乳腺癌研究中AT1 在增生及原位癌階段的表達較高，而在侵襲性階段則降低的研究結論一致［14］。ACE2 和MAS 的基因轉錄水平不一致，這可能是因為MAS 基因轉錄水平受影響轉多，而且目前MAS 的蛋白結構還沒有完全得到確認，嚴格意義上，它作為受體的作用還沒有完全確認，人們對于它的了解相當有限。

本研究雖然病例較少，但因為RAS 系統與原發性肝細胞癌的關系是首次探索，因此具有較好的創新性，今后的研究可以擴大樣本量，并延伸到蛋白水平，進一步確證ACEAng2-AT1 受體軸與ACE2-AngⅠ-7-MAS 受體軸在原發性肝細胞癌中的變化規律，及AT1 受體在原發性肝細胞癌腫瘤生長，肝內轉移方面的作用。

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