六種紅樹植物原位根系及根際土酚酸總量比較分析*

劉 玉，李艷萍，黃雄飛，彭逸生，夏北成

(中山大學環境科學與工程學院∥廣東省環境污染控制與修復技術重點實驗室,廣東 廣州 510275)

植物對根際微生態及根際微生物的影響猜測與其根系分泌物(Root Exudates)密切相關。通過根泌物的組成成分和含量對周圍微生境產生影響，包括化感作用(allelopathy)的影響。多種高等水生植物如鳳眼蓮(Eichhorniacrassipes)等37種能通過分泌、釋放化感物質來抑制藻類生長[1-2]。

植物根泌物種類繁多，并且會因物種、生長階段、營養狀況、微生物種數、土壤狀況、光照及溫度、空氣成分等因素的改變而出現很大的差異。根據已發表的對多種植物的研究成果[3-7]，本研究將已被鑒定的根泌物成分綜合分成八大類：糖類、甾醇類、酶類、有機酸類、核苷酸和黃酮類、生長因子、無機物、其他(糖苷、皂苷、氫氰酸、熒光物質、生長調控物、植物抗毒素、麥根酸類植物鐵載體等)。在各類分泌物中，以有機酸類的化合物種數最多和組成最復雜、分類雜亂，因此，本研究將有機酸類概括分為四大類，包括脂肪酸、氨基酸、羧酸和酚酸。

有機酸廣泛存在于植物根泌物中，由于有機酸類分析相對較簡單且對根系生態有很強的調控作用，因此，對根泌物的研究多從有機酸類開始。但對紅樹植物根泌物的有機酸類的研究目前基本上仍處于起步階段，僅盧豪良等對秋茄根泌物進行了低分子量有機酸且主要是羧酸類的分離鑒定[8]。由于迄今為止尚未見對紅樹植物酚酸類的研究報道，因此，本研究重點對紅樹植物酚酸類進行分析和研究。

酚酸類物質在植物界中廣泛分布，在多種植物根泌物中被證實是化感活性較強的一類物質，但在紅樹植物中相關酚酸類根泌物的研究起步較遲，李春強用正紅樹(Rhizophoraapiculata)根泌物對中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)進行室內化感實驗，推測化感作用的強弱與正紅樹之總酚含量有關但不成正比，也沒有測定出總酚的含量[9]。

此外，大多根泌物的研究都采用室內植物生長模擬實驗，雖然室內模擬容易控制變量，但與原位狀況尚有較大差異。紅樹是否能通過根系分泌作用將酚酸釋放到環境中，從而影響水體及土體中其他生物的生長，本文擬通過對紅樹根系微域區的酚酸總量分析來回答。原位采集廣東湛江國家級自然保護區內六種建群紅樹植物的根系、根際土與非根際土及對照潮溝樣品，測定各樣品中酚酸總量，分析紅樹植物根系分泌酚酸的特點，判斷其可能產生的生態效應，對厘清紅樹林生態機制尤其對根系微生態的作用機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

廣東省湛江紅樹林國家級自然保護區位于廉江市高橋鎮，是現今國內面積最大的紅樹林自然保護區，處于北亞熱帶與南亞熱帶過渡區，地理位置為東經109°41′20″-110°30′19″，北緯20°14′06″-2l°34′15″，總面積20 278.8 hm2[10]。保護區紅樹林區系屬于東方類群，有真紅樹和半紅樹20多種。

1.2 采樣時間與采樣范圍

于2012年10月17日-23日在6種紅樹林內采樣。本次采樣選擇6種純林紅樹桐花樹(Aegicerascorniculatum)、秋茄(Kandeliacandel)、木欖(Bruguieragymnorrihiza)、紅海欖(Rhizophorastylosa)、白骨壤(Avicenniamarina)、無瓣海桑(Sonneratiaapetala)進行。

1.3 六種紅樹根系、根際土、非根際土采樣

在退潮時進行采樣。每種紅樹選擇3個采樣點(即3株紅樹植物)，挖取完整樹根系，刮凈根上附泥，將所得根系剪斷放塑料袋中作為根系樣品(roots)，每棵樹采集根系50 g左右。根際土(rhizosphere soil)為根上附泥及根系1 cm內土。非根際土(non-rhizosphere soil)則為根系外1 cm土，五點采樣法用改裝后的60 mL注射器(去除針頭端)垂直插入土中，然后輕輕拔出，用注射器的推桿將柱狀的泥土樣推出，作為非根際土樣品，每個點采集100 g左右。其中根系樣品用于紅樹根系酚酸總量測定，土樣品用于土中酚酸總量測定。對照點潮溝選擇在紅樹林保護區的外圍靠外海之處，同樣選取3個采樣點進行采樣，每個樣點相距500 m左右。

1.4 根系和土中酚酸總量測定

酚酸通常以游離態、可溶共價結合態以及束縛態存在[11]。考慮紅樹根系以根泌物的形式進入到環境，研究不能人為地用化學方法將不可溶部分提取出來從而提高根系分泌物組分濃度。因此，本文只分析可溶部分的紅樹根系酚酸。根系酚酸浸提劑主要有無機化合物和有機化合物兩類。本研究參考比較多種方法，最終選定用NaOH溶液作酚酸浸提劑[11-14]。酚酸總量測定：采用鐵氰化鉀與三氯化鐵顯色法進行。利用酚酸化合物的酚羥基具有還原性的原理來進行總量的測定。酚酸化合物的還原性可將鐵氰化鉀與三氯化鐵反應生成普魯士藍沉淀，在酸性條件下溶解，所得污綠色物質在730 nm具有最大吸光值[15-16]。

1.4.1 標準曲線制作 以沒食子酸制作標準曲線，分別吸取0.0、0.4、0.8、1.0、1.4、1.6、2 mLρ為10 μg/mL沒食子酸乙醇(φ=70％)溶液于10 mL常量瓶中，加入φ=70％乙醇至2 mL，加入0.8 mL 0.01 mol/L十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液、0.4 mL鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑，搖勻，暗處靜止5 min。1 mol/L醋酸稀釋至刻度，搖勻，暗處靜止30 min。以空白溶液作參比，50 min內，在730 nm處分光光度計測定其吸光度。以吸光度為橫坐標，酚酸總量為縱坐標，制作酚酸總量標準曲線，得線性回歸方程，y= 0.512x+ 0.014，R2=0.998。

1.4.2 樣品制備及測定 將采回的紅樹根刷洗干凈，自然風干后粉碎，過60目篩。土樣自然風干研磨過40目篩。準確稱取紅樹根系樣品1 g，加入100 mLφ=70％乙醇，搖勻，室溫靜止24 h，超聲提取1 h。過濾并用φ=70％乙醇清洗濾渣，合并濾液。濾液在-0.8 MPa 50 ℃條件下旋蒸至干，用φ=70％乙醇溶解梨形瓶中殘留物質，定容至100 mL。

準確稱取土樣2 g，提取方法同根系總酚酸提取方法，最后定容至50 mL。

取適量(≤2 mL)樣品測定酚酸總量，方法同標準曲線測定方法。按線性回歸方程(2)計算酚酸總量。每個點設3個平行，求平均值。

1.5 主要儀器和試劑

主要儀器有：便攜式GPS(合眾思壯G330)，超聲儀(AutoScience，康潔CE-5200A)，旋轉蒸發儀(上海亞榮 RE-52AA)，紫外分光光度計(日本島津UV2450)。主要試劑有：乙醇>95％；丙酮、十二烷基硫酸鈉(SDS)、三氯化鐵(FeCl3)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、沒食子酸(Gallic acid)，分析純；冰醋酸(Acetic acid)，優級純。

1.6 數據處理

數據用Excel、SPSS17.0分析處理，Excel作圖。

2 結果與討論

2.1 紅樹植物根系酚酸總量

六種紅樹根系酚酸總量見圖1(誤差線顯示誤差量百分比為5％)。六種紅樹植物中，以紅海欖根系酚酸總量最高，平均值為8.84 mg/g。無瓣海桑與秋茄根系酚酸總量不穩定，無瓣海桑3個樣品酚酸總量偏差最大，最高值為7.01 mg/g、最低值僅為3.71 mg/g。木欖與桐花樹根系酚酸總量基本持平，木欖平均值為4.84 mg/g，桐花樹平均值為4.69 mg/g，并且，兩種紅樹三個樣品酚酸總量穩定。較之，酚酸總量最低的為白骨壤，3個植物根系中酚酸含量最高為1.96 mg/g，最低僅為1.22 mg/g。

圖1 六種紅樹植物根系酚酸含量

2.2 紅樹根際土與非根際土酚酸總量

六種紅樹植物根際土和非根際土酚酸總量如圖2(誤差線顯示誤差量百分比為5％)。可以看出，①在木欖和白骨壤樣區，均顯示出根際土酚酸總量小于非根際土；而在秋茄和桐花樹，根際土酚酸總量均高于非根際土；無瓣海桑和紅海欖均顯示出有2株植物根際高于非根際。②木欖樣區根際與非根際土壤酚酸總量平均值最高，分別為13.20 μg/g、20.12 μg/g；無瓣海桑酚酸總量平均值根際土小于非根際土，但兩者差值最小(不足1 μg/g)；秋茄林區根際土遠高過非根際土。③在六種紅樹中，紅海欖樣區土壤酚酸含量最低，整體平均值為4.64 μg/g，根際土酚酸總量水平低于非根際土。④在18個樣品中，只有8個樣品酚酸總量根際高于非根際，10個樣品中酚酸總量根際低于非根際。

2.3 紅樹林林內與林外潮溝土酚酸總量比較

六種紅樹林區與潮溝土酚酸總量測定結果如圖3(誤差線顯示誤差量百分比為5％)所示，不同紅樹樣區土中酚酸總量整體水平不同。同種紅樹的根際土與非根際土酚酸總量也不同。在紅海欖、白骨壤、無瓣海桑和木欖中，根際土酚酸總量小于非根際土中，而桐花樹、秋茄則反之。木欖樣區土中酚酸總量最高，樣本整體平均值為16.66 μg/g；無瓣海桑樣區土壤酚酸總量以10.06 μg/g居第二；桐花樹、白骨壤樣區土壤酚酸總量為第三、第四位，平均值分別為8.08、7.99 μg/g；秋茄樣區土壤酚酸高于紅海欖樣區，平均值為6.01 μg/g，紅海欖4.64 μg/g，為樣區土壤酚酸總量最低。潮溝土酚酸總量平均值為8.71 μg/g，可見只有木欖和無瓣海桑樣區酚酸總量高于潮溝。

圖3 六種紅樹根際土與非根際土與潮溝土中酚酸含量比較

3 討 論

多數具有化感作用的酚酸均具有較強的水溶性和成鹽性，在自然條件下易為土壤及植物根系所吸收，從而表現出化感作用[17]，研究酚酸對于解釋紅樹植物的化感作用具有重要意義。根系分泌物的原位研究一直是根際微域環境的前沿和難點[18]。

3.1 根系酚酸總量理論上應低于總酚含量

六種紅樹根系酚酸總量中以紅海欖根系酚酸含量為最高，為8.84 mg/g，但均低于福建九龍江口秋茄老根材總酚含量(195.26±15.50) mg/g和幼根材總酚含量(119.15±2.29) mg/g，也低于廣西山口與廣東湛江紅樹植物紅海欖成熟葉總酚含量200 mg/g。酚酸組成為總酚的一小部分，因此，本文得出的酚酸含量低于總酚實為正常。

3.2 根際土酚酸含量有可能低于非根際土中含量

根際是指受根系分泌物直接影響最強烈、在理化性質和生物學特性上明顯地不同于其原土體的土壤微區域。總酚含量并非總呈現出根際土中含量高于非根際土中的特點，原因有諸多方面，如，環境脅迫、植物生長期、根際微生物效應、化感物質的吸附和解吸附現象等等。

磷脅迫下，向日葵根分泌物中酚類物質的含量顯著增加[19]。萬壽菊水分脅迫時，其酚類物質的含量明顯高于在水分充足時的含量[20]。在3個大豆品種(H25、S10、K2)根泌物中共檢測到2種酚酸，對羥基苯甲酸和香草酸。以H25的對羥基苯甲酸為例，在苗期、花期、鼓粒期、成熟期的含量分別為0.076 9、0.080 6、0.108 5、0.006 1 μg/mL。各品種成熟期對羥基苯甲酸的濃度均低于其它三個時期[21]。說明大豆向根際釋放酚酸物質可能與植物的生長期和代謝活力有關。

蘋果園土壤總酚含量的動態變化為根際土總酚含量高于非根際土。但也有研究表示，酚酸在土壤中是不穩定的。通過外源引入法研究了對羥基苯甲酸、香草酸、香草醛等酚酸類物質在土壤中的殘留動態，發現上述酚酸很容易被土壤吸附或在微生物作用下轉化為其它的物質，經過1周培養后各酚酸殘留率僅為25％～17.5％，大部分酚酸已被微生物分解或被微生物的生長活動而消耗[22]。大多數情況下，植物根際微生物數量和代謝活性比原土體高，因而，有可能出現根際土酚酸含量低于非根際土中的現象。

此外，化感物質在土壤中的吸附和解吸附現象是非常復雜的。Cecchi用14C同位素標記研究了對羥基肉桂酸、阿魏酸、黎蘆酸、香草酸、對羥基苯甲酸5種酚酸在7種土壤中的吸附和解吸附特性。試驗顯示，5種酚酸均出現了不同程度的解吸滯后現象，認為這種現象可能與土壤對5種酚酸的吸附不可逆性直接相關。吸附和解吸附現象高度依賴于有機質含量、酸堿性、金屬氧化物含量及粘粒含量等土壤特性，其吸附動力學機制非常復雜，不能僅僅從土壤的某一特性進行判斷[23]。酚酸類物質進一步降解為無毒性的化合物，其降解程度受到光、溫、水、時間等環境因素的影響[24]。根泌物中能被迅速降解的占60％[25]。

一般情況下，紅樹根系分泌酚酸的總量濃度低于50 mg/L，可能會對根際微生物生長有促進作用，因而導致了酚酸的分解與轉化。因而可能會出現根際土酚酸總量低于非根際土、紅樹林內的酚酸總量低于潮溝中的現象，主要可能是非根際土和潮溝中微生物種類和豐度都較低，因而對有機物的降解作用也較低的緣故。因此，根際土中酚酸含量有可能因微生物分解或土壤吸附及降解作用的綜合作用而低于非根際土中含量。化感效應的發揮是在植物根系分泌能力遠遠超出土壤吸附能力和降解能力基礎之上的最終結果。

3.3 紅樹植物根系中酚酸釋放量很低

為了解紅樹根系是否會將其酚酸類物質釋放入土壤，對根系酚酸總量與根際土酚酸總量做pearson相關性分析，發現相關程度均不同。其中，紅海欖和桐花樹呈正相關，但相關性并不顯著，相關系數r/顯著性p分別為0.729/0.480、0.961/0.179；而木欖、白骨壤、秋茄、無瓣海桑呈負相關且也不顯著，分別為-0.823/0.385，-0.819/0.389，-0.974/0.146，-0.982/0.120。正相關說明紅樹根系有分泌作用，負相關說明根系分泌的酚酸很快降解，相關不顯著說明分泌過程非常復雜。目前對此基本不了解，有待繼續深入研究。

以紅海欖根系酚酸總量平均值8 837.28 μg/g與根際土酚酸總量平均值4.46 μg/g相比較，可知，紅海欖根系中只有極少量酚酸被分泌到根際土,百分釋放量最低，僅為0.050 5％。其它5種紅樹的百分釋放量分別為：桐花樹0.201 6％、木欖0.272 8％、白骨壤0.435 5％、秋茄0.156 6％、無瓣海桑0.185 5％。所有樣點酚酸總量都為根系中遠遠高于根際土及非根際土，根系中的酚酸釋放量很低且不一定以相同比例釋放進環境中，可能與具體樹種、樹齡、生長期、生長環境條件及分泌能力、酚酸與其它物質的共同作用有關。

3.4 化感物質來源廣泛及多種化感物質共同作用

根系分泌物只是土壤中化感物質的來源之一，植物通過根茬腐解、莖葉淋洗等途徑也可以向環境釋放化感物質[26]。土壤中各類微生物的代謝活動也會釋放化感物質。正紅樹中酚酸類化感物質可能并非紅樹粉抑藻的主要化學基礎，還存在著其它化感物質同時起作用[9]。根際微域存在著諸多來源的化感物質且又存在著復雜的相互作用，目前在紅樹林的研究中對此知之甚少，屬紅樹林根際微域環境的前沿和難點問題，有待進行學科交叉研究。

4 結 論

六種紅樹植物根系中以紅海欖根系酚酸總量最高，平均值為8837.28 μg/g，白骨壤最低，平均值為1675.28 μg/g。根際土與非根際土中酚酸總量以木欖樣區平均值最高，分別為13.20 μg/g、20.12 μg/g；紅海欖樣區最低，平均值分別為4.46 μg/g、4.81 μg/g。約55％的樣品非根際土中酚酸總量高于根際土，根際土中酚酸含量可能因微生物分解或土壤吸附及降解的綜合作用而低于非根際土中含量。紅樹植物根系酚酸百分釋放量很低，紅海欖僅為0.050 5％。對于復雜的根際系統，在化感物質的真正來源、分離鑒定及其在生態系統中的遷移形式等方面亟待研究，特別是進行實時監測和動態研究。

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