甲基睪酮(MT)和加氫甲基睪酮(MDHT)浸泡法誘導尼羅羅非魚仔魚雄性化的對比研究*

陳興漢，李 波，葉 衛，張 勇

(1.陽江職業技術學院生命科學與技術系，廣東 陽江 529566；2.中山大學水生經濟動物研究所，廣東 廣州 510275；3.番禺國家級羅非魚良種場,廣東 廣州 511453)

羅非魚屬于鱸形目(Perciformes)、麗魚科(Cichidae)、羅非魚屬(Oreochromis)，具有肉質好、生長快、抗逆性強、養殖成本低以及加工出肉率高等優點，養殖區域已遍布世界 70 多個國家和地區。近年來我國羅非魚產量和出口量一直穩居世界第1位[1]，羅非魚是我國主要的產業化養殖和世界大宗貿易對象[2]。但制約羅非魚產業化養殖推廣最突出的問題是繁殖泛濫，其性成熟早，一年可繁殖好幾代，大大降低了商品魚的規格，嚴重浪費養殖資源，而且造成品種混雜，對生態安全有較大威脅[3]。羅非魚是雄性優勢生長種類，雄魚比雌魚生長快 40％～50％[4]，因此，以單雄性的方式進行推廣養殖是穩定高產的前提，其關鍵技術是“通過性別控制手段以獲得雄性化魚苗”，生產上最常用的是通過雄激素定向誘導。

用激素控制魚類的性別，在美國、日本、菲律賓，以色列以及我國臺灣等國家和地區進行了廣泛研究。到目前為止，至少有31種激素在50種魚類中成功進行定向誘導或誘導性逆轉，其中有大約16種雄激素，成功進行雄性化誘導的魚類有35種[5]，應用最廣泛的是甲基睪酮(MT)，但MT的誘導效果不穩定，主要是因為MT是可芳香化的[6-7]，少量的MT不能起到明顯提高雄性率的效果，過量反而會使雄性率下降或導致不育[8]。而加氫甲基睪酮(MDHT)的誘導效果比MT更穩定，Piferrer[6]、Gale[9]和Wassermann[10]等學者對尼羅羅非魚的研究結果都證明了這一點。MDHT 是不可芳香化的[6,9]，在魚體內不會被芳香化酶催化變成雌激素而導致雌性增多，在高 MDHT 劑量處理時，尚未見導致不育的報道。

在處理方式上，目前應用“投喂法”誘導雄性化最為常見，至少已在青鳉、金魚、鯉、花鳉、斑馬魚、虹鱒、大西洋鮭、大麻哈魚、羅非魚等雌雄異體魚類中獲得成功[11]。有學者研究發現：在魚苗性分化前投喂一段時間的MT都能誘導羅非魚雄性化[12-14]。投喂法雖有效，但長時間大量使用激素會導致環境污染，極少量殘留也會危害人體健康[15-16]。有關“浸泡法”誘導雄性化的研究，國內只有少量浸泡催產或排卵的報道[17-18]、尚未見“浸泡法”誘導雄性化的報道，國外有少量研究報道[9-10,19]。“浸泡法”是在仔魚發育的特定時期，在專門的容器里進行短時間的集中處理，此法所用激素劑量小，避免了對養殖水體的污染。本研究旨在探索一種簡易、穩定又環保的雄激素“浸泡法”誘導尼羅羅非魚仔魚雄性化，為生產實踐提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗用魚 尼羅羅非魚仔魚取樣于廣東省國家級羅非魚良種場(番禺)。選取健壯、無病，卵顆粒大、發亮，卵粒偏黃，魚體色發紅的雌魚作為母本；同時選擇健壯，無病，可以擠出白色精液的雄魚作為父本。雌雄(1 ∶ 1)飼養于4 m×1.5 m×1.2 m(長×寬×深)水泥池。投喂普通羅非魚成魚飼料，保持微流水。雌魚自行產卵孵化。在仔魚孵出前 1～2 d，把卵從親魚口腔中取出，在孵化裝置中孵化。待仔魚全部孵出后，飼養于規格為40 cm×25 cm×25 cm(長×寬×高)的白色塑料箱中。按孵出后天數(DPH,Days Post Hactching)計，分別于1 DPH(出膜第1天)、7 DPH(卵黃囊消失)和13 DPH時再分組進行試驗，每組100尾魚。所有的魚池、用品都做常規消毒。

1.1.2 藥品和試劑 MT購自Sigama(USA)公司，MDHT為MD(USA)公司產品。計算出一次實驗所需MT或MDHT的總劑量，然后稱取盛放于一棕色玻璃瓶中(體積約15 mL)，再加入分析純酒精(φ=99％)溶解，使保存劑量為c= 10 μg·μL-1，充分振蕩溶解后放入 4 ℃ 冰箱保存，實驗時再取用。雌雄性腺鑒別時采用鐵醋酸洋紅和結晶紫染色。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計 MT和MDHT試驗設計采用簡單比較法正交試驗[20]，略作修正。處理時期(Treatment period)分別為1,7,13 DPH，激素劑量(Hormone dose)分別為200,600,1 800,5 400 μg·L-1，持續時間(Treatment duration)分別為 2,4,8 h。每個處理組設兩個平行，另設兩個自然對照組(Ctr)。激素浸泡處理時，把仔魚分裝于約5 L的玻璃缸后，向每個缸里放一個充氣石，保證缸里供氧充足及激素混合均勻。準備開始進行激素浸泡處理時，用加樣槍吸取所需體積的MT或MDHT溶液(保存劑量為10 μg·μL-1)加入玻璃缸，以所需體積最大的那個缸為基準，向其它缸里加入相應分析純酒精(φ=99％)，以補充酒精體積差值，消除由于水體酒精劑量不同而帶來的誤差。處理持續時間結束時，把仔魚撈出，在清水里洗兩遍，然后轉到規格為50 cm×50 cm×50 cm 的網箱中。網箱懸掛于水泥池中，保持微流水，每天清洗網箱一次，每天投喂鰻魚飼料3次。飼養至60 DPH，存活的魚全部進行性別檢測。

1.2.2 性別檢測 待魚飼養至60 DPH時，通過性腺壓片分辨雌雄，人工解剖取性腺，解剖前向魚體腔注射約1 mL的φ=5％醋酸溶液，使性腺變白，以利于取出性腺。性腺取出后，滴少許鐵醋酸洋紅進行染色，壓片后在 ZEISS 顯微鏡下觀察判斷雌雄。雌魚性腺表面可見清晰卵粒，雄魚性腺表面無清晰細胞間隔。如壓片不能清楚分辨雌雄時，揭開蓋玻片，滴少許結晶紫溶液，見到明顯卵細胞的為雌性，無卵細胞樣的則為雄性。

1.3 數據分析

采用Excel2003進行數據整理，并運用SPSS18.0版本進行差異顯著性分析。用卡方(χ2)檢驗[20-21]比較各組的雄性率的差異，進行多重比較時，為了降低Ⅰ類誤差，采用Bonferroni校正法對顯著性水平進行校正，校正的顯著性水平α′=α/比較次數[3]。

為了解MT、MDHT誘導7 DPH與13 DPH仔魚雄性率的差異，需對7 DPH與13 DPH雄性率最高的組進行兩個百分數樣本差異顯著性t檢驗[22]，在 Excel 2003里編輯公式(1)，根據公式(1)求得t值，然后查t分布表，以比較差異的顯著性。

(1)

(1)式中，x1為第一樣本中某事件發生的次數，x2為第二樣本中某事件發生的次數，n1為第一個樣本含量，n2為第二個樣本含量，SQRT 表示返回數值的算術平方根。

2 結 果

2.1 MT與MDHT浸泡誘導1 DPH仔魚的雄性率

由圖1可知：處理時期為1 DPH，持續時間為 4 h 時，不同MT、MDHT 劑量組(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)的雄性率和對照組(Ctr)比較沒有顯著差異(P>0.05)，各組間兩兩比較也沒有顯著差異(P>0.05)。

圖1 處理時期為1 DPH，持續時間為 4 h時，不同MT、MDHT劑量組的雄性率

由圖2可知：處理時期為 1 DPH，MT或MDHT劑量為600 μg·L-1時，不同持續時間組(2,4,8 h)的雄性率和對照組比較沒有顯著差異(P>0.05)，各組間兩兩比較也沒有顯著差異(P>0.05)。這說明用MT 或MDHT 浸泡誘導1 DPH的仔魚時，激素劑量為200,600,1 800或5 400 μg·L-1，持續時間為2,4或8 h，都不能顯著提高雄性率。

圖2 處理時期為1 DPH，MT、MDHT劑量為600 μg·L-1 時，不同持續時間組的雄性率

2.2 MT與MDHT浸泡誘導7 DPH仔魚的雄性率

由圖3可知：處理時期為 7 DPH，持續時間為4 h時，不同MT、MDHT劑量組(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)的雄性率都顯著高于對照組(P<0.05)，MT(1 800,5 400 μg·L-1)兩組的雄性率顯著低于 MT(600 μg·L-1)、MDHT(600,1 800 μg·L-1)三組(P<0.05)，MDHT各劑量組(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)兩兩比較無顯著差異(P>0.05)。這表明當MT誘導 7 DPH 仔魚的劑量為600 μg·L-1時雄性率最高，而劑量為1 800,5 400 μg·L-1時雄性率明顯下降；MDHT 的劑量為600,1 800 μg·L-1時雄性率最高，同時劑量為200,5 400 μg·L-1時雄性率沒有明顯下降。

圖3 處理時期為7 DPH，持續時間為4 h時，不同MT、MDHT 劑量組的雄性率

圖4 處理時期為7 DPH，MT、MDHT劑量為 600 μg·L-1時，不同持續時間組的雄性率

由圖4 可知：處理時期為 7 DPH，MT或MDHT劑量為600 μg·L-1時，不同持續時間組(2,4,8 h)的雄性率都顯著高于對照組 (P<0.05)，MT(8 h)組的雄性率顯著低于MT(4 h)組的雄性率(P<0.05)，MDHT各持續時間組(2,4,8 h)兩兩比較無顯著差異(P>0.05)。這表明當用MT誘導7 DPH仔魚時，持續時間為 4 h 效果最好、而 8 h的雄性率降低；當用MDHT時，3個持續時間組(2,4,8 h)的雄性率無顯著差異。

2.3 MT與MDHT浸泡誘導13 DPH仔魚的雄性率

由圖5 可知：處理時期為 13 DPH，持續時間為4 h時，MT(200,600,1 800 μg·L-1)及 MDHT(200，600 μg·L-1)這5組的雄性率顯著高于對照組(P<0.05)，MT(200 μg·L-1)和 MDHT(200 μg·L-1) 2組雄性率最高、分別為87.62％和82.31％。MT(5 400 μg·L-1)、MDHT(1 800,5 400 μg·L-1)這3組的雄性率和對照組比較無顯著差異(P>0.05)，MT(5 400 μg·L-1)組的雄性率顯著低于MT(200; 600 μg·L-1)和MDHT(200 μg·L-1)3組(P<0.05)，MDHT 各劑量組(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)兩兩比較無顯著差異(P>0.05)。

圖5 處理時期為13 DPH，持續時間為4 h時，不同MT、MDHT 劑量組的雄性率

由圖6 可知：處理時期為 13 DPH，MT或MDHT劑量為200 μg·L-1時，MT(2,4 h)和MDHT(2,4 h)這4組的雄性率顯著高于對照組(P<0.05)，MT(8 h)組的雄性率顯著低于MT(4 h)組(P<0.05),與MT(2 h)組無顯著差異(P>0.05)，MDHT 各持續時間組(2,4,8 h)兩兩比較無顯著差異(P>0.05)。

圖6 處理時期為13 DPH，MT、MDHT劑量為200 μg·L-1 時，不同持續時間組的雄性率

2.4 MT與MDHT浸泡誘導7 DPH與13 DPH仔魚最高雄性率的t檢驗

結合圖3-6 可知，MT、MDHT 浸泡誘導7 DPH與13 DPH仔魚雄性率最高的處理組合(DPH-h-μg·L-1)分別為：MDHT(7-4-600)、MT(7-4-600)、MT(13-4-200)和MDHT(13-4-200)這4組，雄性率分別為98.81％、98.34％、87.62％和 82.31％。這4組分別進行了2個百分數樣本差異顯著性t檢驗(見圖 7)。結果為：MDHT(7-4-600)、MT(7-4-600)這2組的雄性率顯著高于 MT(13-4-200)、MDHT(13-4-200)這2組(P<0.05)，MDHT(7-4-600)與 MT(7-4-600)兩組間無顯著差異(P>0.05)，MT(13-4-200)與 MDHT(13-4-200)兩組間也無顯著差異(P>0.05)。這證明 MT、MDHT 浸泡誘導 7 DPH仔魚的雄性率要顯著高于誘導 13 DPH仔魚的雄性率。

圖7 MT 與 MDHT誘導 7 DPH 與 13 DPH 仔魚最高雄性率的t檢驗

3 討 論

3.1 激素敏感期

激素敏感期(Hormone sensitive period)是指動物胚胎發育的某一特定階段，在該階段內激素能對性別決定起主導作用[23-24]。如要使用激素實現性別的定向誘導，首先要確定激素敏感期。從本文的結果看，MT、MDHT誘導7 DPH尼羅羅非魚仔魚的雄性率最高分別為98.81％和98.34％。Gale等[9]用MT和MDHT分別浸泡處理了尼羅羅非魚，處理劑量為500 μg·L-1、處理時期為13 DPF(Days post fertilization，受精后 13 d，相當于7 DPH)、持續時間為 3 h，雄性率分別達87％和94％；Wassermann和Afonso[10]也用MT和MDHT浸泡處理了尼羅羅非魚，處理劑量為1 800 μg·L-1、處理時期為14 DPF(相當于7～8 DPH)、持續時間為 4 h，雄性率分別達91.6％和100％。另外，我們的研究結果通過t檢驗證明，13 DPH仔魚也具有激素敏感性，只是不如7 DPH仔魚激素敏感性高。以上結果表明：尼羅羅非魚仔魚的激素敏感期應為包括7 DPH在內的一個“時段”。此時生殖脊開始出現、原始性腺尚未形成[25]，推測這個“時段”應該在生殖脊開始出現到原始性腺形成之前，此時性腺發育具有較強的兩性分化可塑性[26]。但具體確定這個“時段”還有待進一步研究。

3.2 MT與MDHT的誘導效果對比

本文結果發現：MT誘導7 DPH仔魚的劑量為600 μg·L-1時，雄性率最高(98.81％)；MDHT 的劑量為600,1 800 μg·L-1時，雄性率最高(分別為98.34％、98.39％)。當用MT誘導7 DPH仔魚時，持續時間為4 h雄性率最高；當用MDHT時，3種持續時間組(2,4,8 h)的雄性率都較高。Gale等[9]所采用的MT和MDHT處理劑量為500 μg·L-1，持續時間為3 h，雄性率分別為87％和94％。相比較而言，本試驗的雄性率更高，這可能是Gale等所采用劑量500 μg·L-1和持續時間3 h與本研究的600 μg·L-1和4 h有所差異引起的。Wassermann和Afonso[10]所采用的MT和MDHT處理劑量為1 800 μg·L-1，持續時間為4 h，雄性率分別為91.6％和100％。這和本文結果相符。

本試驗研究還發現：MT誘導7 DPH仔魚的劑量為1 800 μg·L-1和5 400 μg·L-1時，雄性率相比 200 μg·L-1和600 μg·L-1而言明顯下降(P<0.05)；而 MDHT各劑量組(200,600,1 800,5 400 μg·L-1)的雄性率無顯著差異(P>0.05)。當用MT誘導7 DPH仔魚時，持續時間為4 h效果最好、而8 h的效果有所下降；當用MDHT時，3種持續時間組(2,4,8 h)的雄性率無顯著差異(P>0.05)。這些現象可能與MT可芳香化[6-7]有關，當 MT 劑量較高(1 800,5 400 μg·L-1)或持續時間較長(8 h)時，過量的 MT 在芳香化酶的催化下產生雌二醇(E2)[27]，從而導致雄性率相對降低。MDHT是不可芳化的[6,9]，相對于可芳化的 MT 而言，MDHT劑量較高(1 800,5 400 μg·L-1)和持續時間較長(8 h)時，雄性率并無顯著降低，且MDHT劑量較低(200 μg·L-1)和持續時間較短(2 h)時，雄性率也無顯著降低。因此，總體而言 MDHT 浸泡誘導雄性化的穩定性較 MT 好，MDHT表現出更好的應用潛力。

3.3 “浸泡法”的應用前景

本文結果表明，運用MT和MDHT浸泡誘導尼羅羅非魚仔魚雄性化的雄性率最高分別可達98.81％和98.39％，雄性率能夠達到生產應用需求。尤其是MDHT表現出更好的應用潛力。誘導雄性化不光在生產上應用，在科研中也有著巨大的應用價值，性反轉魚在性別決定機制、染色體組學和三系配套技術[28-29]等研究中早有應用，通過“浸泡法”得到的“轉化系”的魚，必將為這些基礎理論的研究提供新的研究題材。

傳統的激素誘導處理方式有投喂法、注射法和埋植法。投喂法最為常見，使用時先把激素溶解在酒精中，然后拌入飼料中投喂，此法雖有效，但在魚的消化過程中激素的效應會降低，而且投喂法耗時長、激素用量大，會導致環境污染，極少量殘留也會危害人體健康[15-16]；注射法和埋植法費時費力，一般只在科研中有應用價值，而且不能應用于胚胎或仔魚，這也限制了其推廣使用；“浸泡法”是一門新興的技術，已在大馬哈魚中成功應用[6,30]，其方法簡便易行，一般在專門的容器或裝置進行短時間的集中處理，由于浸泡激素呈全面均勻分散進入魚體皮下組織內，機體組織吸收效果好，此法所用激素劑量小，避免了對養殖水體的污染，這對保護生態環境有著較為重要的意義。

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