大鼠眼球的生物光子檢測及其生物學意義*

姜偉業，楊 釗，趙季平

(西北大學生命科學學院，陜西 西安710069)

生物光子是生物體(或細胞)自發的或被誘導而輻射出的一種極微的光子流。代謝活動特別是天然脂質過氧化作用是生物光子的重要來源[1-3]。體內光感受器代謝旺盛，其耗氧量最大，且不飽和脂肪酸含量最高[4]。此外，在視網膜正常功能條件下，外界光線可以引起脂質過氧化作用[5]。因此理論上視網膜不但能夠輻射出較強的自發生物光子而且可以輻射出較強的誘發生物光子。

在正常視覺情況下，由于生物光子過于微弱，人眼不能夠識別生物光子，但在電、磁、機械等刺激存在的條件下或在視網膜暗適應過程中，生物光子特別是誘發生物光子可能被光感受器細胞所識別。據此，Bókkon等[2,3,6]用光化學理論來解釋這些現象，他們認為生物光子可能在光幻視、視覺后像、視網膜暗噪音等現象中扮演重要角色。

然而至今為止，人類或動物的眼睛(特別是視網膜)可以自發的或在可見光誘導下輻射出生物光子的實驗證據尚未見報道。在本研究中，我們利用 EM-CCD 為基礎構建生物光子檢測系統首次對新分離的大鼠全眼、晶狀體、玻璃體以及視網膜樣品的自發的生物光子和可見光誘導產生的生物光子進行檢測，為 Bókkon等提出的假說提供直接的實驗證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其飼養條件

動物：Sprague -Dawley(SD)大鼠(200±15)g購自中山大學醫學院實驗動物中心(動物質量合格證編號：No.00006656)。整個實驗共使用了12只SD大鼠，其中5只用于預實驗，7只用于本研究結果的數據分析。實驗對每只動物的一只全眼和從另一只眼分離得到的晶狀體、玻璃體、視網膜進行觀察。

動物飼養條件：12 h晝夜節律光照，自由飲水、攝食，溫度 18～25 ℃，相對濕度40％～50％、過濾要達到 0.5 μm/m3≤5 個、氨濃度/m3≤14 mg，飼料為普通動物飼料，開放式飼養。

1.2 儀器與設備

EM-CCD及其控制器(型號：C9100-13，日本濱松光子學株式會社產)；暗箱(90.5 cm×75.5 cm×110.5 cm，上海艾道艾機械設備有限公司產)；臺式計算機(戴爾公司產，內裝 Simple-PCI 軟件)； 體視顯微鏡(型號：AZ100，含 AZ-Plan Apo 0.5×鏡頭，尼康株式會產)；低溫冷卻液循環泵(型號：DLSB-5L/20，鞏義市子華儀器有限責任公司)；蠕動泵(型號：BT100-1 J，保定蘭格恒流泵有限公司)；3 mm高亮 LED燈(額定電壓3 V；直流供電；紅，621～623.5 nm，4 500～5 000 mcd；綠，515～520 nm，12 000～14 000 mcd；藍，460～465 nm，4 000～5 000 mcd)；高端超純水系統(型號：AJY-6000-U型，艾科浦公司產)。

1.3 樣品預處理

所有的動物實驗均通過中山大學動物管理委員會認可。大鼠斷頭處死后，將眼睛和眼眶迅速分離。在冰水浴的生理鹽水中，用顯微手術剪將周圍結締組織和殘余視神經與眼球仔細分離。在手術顯微鏡下，用顯微手術剪將其中一個眼球的角膜沿角鞏緣剪下，并將晶狀體、玻璃體與視杯(視網膜)小心分離。另一只將眼睛周圍的結締組織去除后保持全眼，不做分離。

1.4 實驗步驟

①按圖 1的順序將樣品依次放置在體視顯微鏡的載物臺上，按標準的操作規則啟動 EM-CCD，先拍攝定位圖像，然后關閉暗箱，避光 20 min以上，以排除環境光引起的誘發光的影響；②將 EM增益設為 1 200，掃描模式設為11 MHz，光子圖像模式設為0，Binning 設置為 2×2，10幀/min實時連續拍攝獲取組織光子輻射的圖像和數據；③拍攝 50幀(即拍攝 5 min)后暫停(結果作為本底光子輻射)，用 LED燈(紅色)對樣品照射10 s(照射過程中，暫停 EM-CCD采集數據)，然后繼續拍攝150幀(即拍攝20 min)；④重復步驟2-3，光照時間分別延長至 20 s和 40 s；⑤分別用綠色 LED 和藍色 LED 燈替換紅色的LED燈，重復步驟2-4。

1.5 圖像處理和數據提取

用 EM-CCD配備的圖像處理分析軟件(Simple PCI 6.0)對圖像和數據進行處理，具體過程如下：①如圖1A所示將定位圖片疊加在數據圖像上(這種疊加不影響對圖像數據的分析)，并根據定位圖片所示的位置、大小用圓圈將樣品所處的目標區域圈出；②將灰度閾值設為 10 000，將大于灰度值 10 000 的點用其附近的點替代，這是為了在一定程度上排除宇宙射線的影響；③提取目標區域的平均強度值(圖像平均灰度值)。

圖1 眼球(及其各部分)誘發光成像和圖像分析

1.6 統計學分析

2 實驗結果

預實驗表明，全眼及分離的眼組織(晶狀體，玻璃體和視網膜)在暗室內避光30 min后達到了穩定的本底(包括背景)基值。因此，每次實驗在暗室內避光30 min后開始記錄300 s的基礎值，然后分別用單色的紅光、綠光、藍光 LED 連續照射組織樣品(全眼、晶狀體、玻璃體、視網膜)10，20和40 s后開始記錄誘發光隨時間改變的情況。

如圖 2 A-C、3 A-C、4 A-C和5 A-C所示，所有樣品均具有明顯的延遲發光現象，并顯示類似的衰減曲線(由峰值迅速下降)，10 min左右后恢復到基礎值。整體上來講，在不同波長的 LED光源照射下，同一波長的 LED光源隨著光照時間的延長，組織樣品誘發光的峰值強度有遞增趨勢，但大部分組織在照射20 s后達到了峰值，因而光照20 s與光照40 s相比，其峰值強度沒有統計學差異(見圖2D、3 D、4 D和 5 D)。提示光照已經基本飽和，進一步延長光照時間不能使誘發光的峰值強度進一步增強。

圖 2 光照時間長度對全眼延遲發光的影響

圖3 光照時間長度對視網膜延遲發光的影響

圖4 光照時間長度對玻璃體延遲發光的影響

圖5 光照時間長度對晶狀體延遲發光的影響

此外對3種不同波長的光(藍、綠、紅)對全眼和不同眼組織(晶狀體、玻璃體和視網膜)照射40 s后，其在1 min之內誘發光強度的衰減情況進行了分析。以每6 s的時段為一個點對每一時段的總發光強度進行了統計學分析。如圖7所示，盡管在每一時段點的結果可變性較大，但從整體上看有一定的規律，晶狀體和玻璃體與全眼的衰減過程存在明顯的差異，而視網膜與全眼的差異不大。

在光子數大致相同的情況下，紅光所引起的誘發光要明顯弱于綠光和藍光所引起誘發光，提示紅光誘發延遲發光的能力要弱于其他兩種光。但這種差異在峰值位置表現最為明顯，隨著衰減時間的延長，差異逐漸減少以至消失，并最終都恢復到基線水平(圖8)。

圖6 刺激光源波譜對眼球(及各部分)延遲發光的影響

圖7 光刺激 40 s后眼球(及各部分)發光強度比較

圖8 視桿細胞離散暗噪聲的生物超弱發光(生物光子)理論

3 實驗結果的生物學意義

實驗表明，新鮮分離的大鼠眼球各部分存在自發光和可見光誘導的延遲發光現象。因此，我們認為在正常條件下，從周圍環境進入眼內的光子除直接作用于視網膜產生視覺外，還可以作用于眼球不同的部分導致誘發光(生物光子)，這一部分生物光子以及組織內由于氧化代謝而生成的生物光子與從環境中進入眼內的光線相比可能“微不足道”，然而，但在特定條件下可能有重要的生物學意義，特別是對于理解到目前為止還不清楚的一些視覺現象有重要的價值。

3.1 生物光子與光幻視

新近 Bókkon提出一種光幻視起因的新觀點，他認為光幻視是由于眼內氧化代謝產生的自由基和激發態生物分子過量產成進而發出生物光子的結果，并認為這些物質的過量產生可以引起視覺系統各部分中的細胞生物光子的瞬間增強。當這種過量的生物光子超過一定的閾值，在我們腦海中可能就會出現光幻視。換句話說，大腦不能辨別這些光子究竟來自外界還是視網膜本身[7]。

Bókkon 關于視網膜光幻視的假說已經被 Narici等[8]的實驗初步證實。根據這項研究，由電離輻射(宇宙射線)誘導生成的自由基可以通過脂質過氧化作用產生化學發光。這些化學發光所產生的光子被光感受器吸收，進而啟動光子轉導級聯反應，從而產生光幻視。

眾多前人的實驗表明，視網膜光幻視通常由電、磁、機械刺激引起。本研究結果表明，視網膜光幻視可能是由于誘發和自發生物光子作用于視桿細胞的結果。 總之，我們及前人的研究結果表明，視網膜光幻視的出現可能是由于誘發和自發生物光子作用于視覺細胞引起視假象的緣故。

3.2 生物光子與視網膜暗噪音

我們的實驗結果表明，在體外，新分離的大鼠眼(包括晶狀體、玻璃體、視網膜以及全眼)能夠輻射出生物光子。如圖3-7所示，晶狀體、玻璃體、視網膜和全眼能夠連續的基準強度的生物光子。該結果表明，眼球的生物光子具有多源性。在明視覺(Photopic vision)或暗視覺(Scotopic vision)中，連續的生物光子輻射可以忽略。但在視網膜暗適應過程中，生物光子可能起到重要作用。

實驗表明，眼睛多個部位都可以連續產生生物光子(生物超弱發光)，這可以在一定程度上支持Bókkon和Vimal提出的視桿細胞離散暗噪聲的生物超弱發光(生物光子)假說(參見圖8)。雖然作用程度不同，但熱激活過程和生物光子在離散暗噪音的形成中可能都發揮作用。此外，當氧化反應所生成生物光子(可漂白或激活色素)的能量低于視色素(Visual pigment)的活化能時，分子的熱能或許能夠發揮協同作用，共同激活視色素。

1)給定的視錐或視桿細胞可能發出一個生物光子， 光子方向改變后有被其自身吸收。

2)視錐或視桿細胞可以吸收臨近細胞中不飽和脂肪酸脂質氧化所發出的光子。

3)視蛋白也可以吸收線粒體氧化代謝過程中所產生的生物光子。

參考文獻：

[1]POPP F A,NAGL W,LI K H,et al.Biophoton emission new evidence for coherence and DNA as source[J].Cell Biophysics,1984,6(1):33-52.

[2]RUTH B,POPP F A.Experimental investigations on ultraweak photonemission form biological systems[J].Zeitschrift für Naturforschung C:A Journal of Biosciences,1976,31(11/12):741-745.

[4]QUICKENDEN T I,COMARMOND M J,TILBURY R N.Ultraweak bioluminescence spectra of stationary phase Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe[J].Photochemistry and Photobiology,1985,41(5):611-615.

[5]TAYLOR G W,HARVEY E N.The theory of mitogenetic radiation[J].Biological Bulletin,1931,61(3):281-293.

[6]LORENZ E.Search for mitogenetic radiation by means of the photoelectric method[J].The Journal of General Physiology,1934,17(6):843-862.

[7]韓金祥.基于生物光子相干性理論的經絡本質探討[J].生物醫學工程研究,2010,29(3):147-151.