添加乙酸對西藏燕麥和紫花苜蓿混合青貯發酵品質和有氧穩定性的影響

李君風，孫肖慧，原現軍，郭剛，4，肖慎華，巴桑，余成群，邵濤＊

（1.南京農業大學動物科學技術學院 飼草調制加工與貯藏研究所，江蘇 南京210095；2.中國科學院地理科學與資源研究所，北京100101；3.西藏日喀則地區草原工作站，西藏 日喀則857000；4.山西農業大學動物科學技術學院，山西 太谷030801）

西藏地處青藏高原西南部，素以“世界屋脊”著稱，由于海拔高度不同，農區和牧區明顯分離［1］。藏北牧區冬寒期長達7個月，天然草地生長期短暫，生產力水平低，難以為草食動物提供充足的飼草；畜牧業生產上存在“冬瘦、春死、夏肥、秋壯”的惡性循環［2－3］，而農區海拔較低，有較多的降雨量和較高的溫度，牧草產量相對較高，所以在農區開展優質牧草種植，調制優質青貯飼料供牧區冬春季節草食動物利用，是解決藏北牧區冬春季節飼草料短缺的有效途徑。由于西藏地區交通運輸不便，青貯飼料開窖并分發到養殖戶，需要較長時間，加之養殖戶不懂得科學管理，剩余的青貯飼料散堆散放，易造成發霉變質，飼喂霉變的青貯飼料會影響家畜健康和畜產品品質，因此在西藏地區研究青貯飼料的發酵品質及有氧穩定性顯得尤為重要。

乙酸是發酵抑制劑，同時可以參與動物的能量代謝，也是反芻動物合成脂肪的主要前體物質，能有效地提高乳脂率，對動物無毒害作用。Schmidt和Kung［4］研究表明，添加乙酸后能有效地降低pH，抑制青貯飼料中好氧性微生物的活性，防止青貯飼料的腐敗變質。因此，將外源性的乙酸作為添加劑，能有效地提高青貯飼料的發酵品質及有氧穩定性。

燕麥（Avenasativa）和紫花苜蓿（Medicagosativa）是西藏主要栽培牧草，燕麥水溶性碳水化合物含量高，粗蛋白含量低，單獨青貯易于成功［5］。紫花苜蓿富含蛋白質、礦物質和維生素，是目前國內外廣泛栽培的豆科牧草之一，應用前景廣闊，但由于其含糖量低、緩沖能高，不能保證青貯過程中乳酸發酵占優勢地位，因此單獨青貯較難成功。將兩種牧草混合青貯，既能解決紫花苜蓿單獨青貯難以成功的問題，又可以有效調控青貯原料的乳酸菌發酵底物和青貯飼料的蛋白質水平，改善青貯飼料發酵品質的同時也提高了青貯飼料的營養價值和適口性。王奇等［6］關于西藏葦狀羊茅（Festucaarundinacea）和箭筈豌豆（Viciasativa）混貯的研究結果也表明了豆科牧草和禾本科牧草混合青貯能改善青貯飼料的發酵品質和營養價值。本試驗根據燕麥和紫花苜蓿混合青貯比例篩選研究結果的基礎上，探討添加不同水平的乙酸對混合青貯發酵品質和有氧穩定性的影響，以指導西藏地區優質青貯飼料的生產和利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在西藏山南地區貢嘎縣崗堆鎮吉納村試驗地開展，該地區位于西藏自治區南部，處于雅魯藏布江中游河谷區和江南高山寬谷區。地勢西高東低，平均海拔3750m。屬高原帶干旱季風氣候區，日照射時間長，氣溫日差較大，年差較小，冬春寒冷多風，雨季降水集中，形成長冬無夏，春秋相邊的氣候特點。年降水量為356.6mm，集中在6－9月份。牧草和糧食作物均在該季節收獲。

試驗將種植于西藏山南地區貢嘎縣崗堆鎮吉納村試驗地的燕麥和紫花苜蓿于2012年9月15日刈割，刈割后在田間用鍘刀切成2cm左右，將70%燕麥和30%紫花苜蓿充分混勻，作為青貯材料。燕麥為乳熟期，紫花苜蓿處于第2茬初花期。各青貯材料化學成分見表1，微生物組成見表2。

表1 青貯前燕麥和紫花苜蓿主要化學成分Table 1 Chemical composition of fresh oat and alfalfa before ensiling

表2 青貯前燕麥和紫花苜蓿微生物組成Table 2 Microbial composition of fresh oat and alfalfa before ensiling

1.2 試驗設計

試驗采用完全隨機設計，設對照組和3個不同添加劑處理組：①對照組（CA，無添加）；②0.3%乙酸添加組（0.3A）；③0.4%乙酸添加組（0.4A）；④0.5%乙酸添加組（0.5A），在青貯后第30，45，60天分別打開青貯窖，取樣分析發酵品質；剩余實驗室青貯窖在青貯60d后打開，用鑷子掏松，使空氣充分滲入，在隨后的第5，10，15天取樣分析有氧暴露過程中各項指標的變化。每個處理各個時間點各5個重復，共計120個實驗室青貯窖。

1.3 試驗方法

1.3.1 青貯飼料的調制 將燕麥和紫花苜蓿分別刈割，用鍘刀切成2cm左右，按試驗設計比例（7∶3）稱取混勻，加入添加劑，充分混勻后裝填至2L的實驗室青貯窖中，壓實蓋上內外蓋，并用膠帶密封，置于室溫條件下保存。

1.3.2 樣品處理 在青貯第30，45和60天分別打開實驗室青貯窖取出全部青貯飼料，將其混合均勻稱取35g放入100mL的廣口三角瓶，加入70g去離子水，4℃浸提24h，然后通過2層紗布和定性濾紙過濾，所得液體為青貯飼料浸提液，置于－20℃冷凍冰箱保存待測。濾液用來測定pH值、乳酸（lactic acid，LA）、氨態氮（ammonia nitrogen，AN）和揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs），將剩余部分青貯飼料收集烘干，測定干物質（dry matter，DM）、總氮（total nitrogen，TN）以及水溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）。

1.3.3 測定項目及分析方法 原料草和青貯飼料在65℃烘箱中干燥60h至恒定重量，測定干物質含量（dry matter，DM）；緩沖能（buffer capacity，BC）測定用鹽酸－氫氧化鈉滴定法；pH值用pH211型精密pH計（HANNA公司）測定；乳酸含量（lactic acid，LA）用對－羥基聯苯比色法測定；水溶性碳水化合物用蒽酮硫酸比色法測定；氨態氮采用苯酚－次氯酸鈉比色法測定；總氮用KjeltecTM2300型全自動凱氏定氮儀測定；乙酸、丙酸、丁酸等揮發性脂肪酸用GC－14B型氣相色譜儀（日本島津公司），色譜條件：柱溫125℃，汽化室溫度180℃，檢測器溫度220℃，檢測器FID，載氣為氮氣，壓力為0.05MPa，氫氣壓力為0.05MPa，空氣壓力為0.05MPa［7］。乳酸菌、好氧性細菌、酵母菌和霉菌數量采用平板計數法，分別選用MRS（deMan－Rogosa－Sharpe）瓊脂培養基、營養瓊脂培養基（nutrient agar）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar），35℃恒溫培養2～3d，對菌落數進行計數［8］。

1.4 數據處理

采用SAS（8.2）軟件對試驗數據進行單因子方差分析（One－Way ANOVA），并用鄧肯氏（Duncan）方法對處理間及青貯天數間平均數進行多重比較（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 青貯原料燕麥和紫花苜蓿化學與微生物成分分析

青貯原料燕麥干物質、水溶性碳水化合物、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均高于紫花苜蓿（P＜0.05）；而紫花苜蓿的粗蛋白含量、緩沖能較燕麥高（P＜0.05）（表1）。紫花苜蓿的好氧性細菌數量高于燕麥（P＜0.05），其他微生物的數量兩種材料間差異不顯著（P＞0.05）（表2）。

2.2 添加乙酸對燕麥和紫花苜蓿混合青貯過程中干物質、pH和乳酸含量的影響

整個青貯過程中，各組干物質含量變化不顯著（P＞0.05）（表3）。各組pH值變化不大，但隨著乙酸添加量的增加，pH值呈下降趨勢，且各處理組pH值均顯著（P＜0.05）低于對照組，0.4%與0.5%乙酸處理組顯著低于0.3%乙酸處理組（P＜0.05）。隨著青貯時間的延長，乳酸含量總體呈上升趨勢，各處理組乳酸含量均顯著高于對照組（P＜0.05），在青貯第45天，0.4%乙酸添加組乳酸含量顯著高于其他組（P＜0.05），發酵60d后處理組仍顯著高于對照組（P＜0.05），但處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 添加乙酸制劑對混合青貯過程中pH、干物質和乳酸含量的影響Table 3 Effect of adding acetic acid on pH，DM and LA contents of mixed silages during ensiling

2.3 添加乙酸對燕麥和紫花苜蓿混合青貯過程中揮發性脂肪酸含量的影響

隨著青貯時間的延長，各組乙酸含量呈升高趨勢（表4），處理組乙酸含量高于對照組（P＜0.05），并隨著乙酸添加量的增加，青貯飼料中乙酸含量明顯提高（P＜0.05），但到青貯第60天，各處理組間乙酸含量差異不顯著（P＞0.05）。整個青貯過程，丙酸、丁酸含量各組間差異不顯著（P＞0.05），總揮發性脂肪酸變化趨勢與乙酸一致。

表4 添加乙酸制劑對混合青貯過程中揮發性脂肪酸含量的影響Table 4 Effect of adding acetic acid on volatile fatty acid contents of mixed silages during ensiling

2.4 添加乙酸對燕麥和紫花苜蓿混合青貯氨態氮/總氮、乳酸/乙酸和水溶性碳水化合物含量的影響

在整個青貯過程中乳酸/乙酸雖有波動（表5），但整體變化不顯著（P＞0.05），添加0.4%乙酸處理組乳酸/乙酸最高。各組氨態氮/總氮呈逐漸上升的趨勢，在青貯第60天，各處理組均低于對照組（P＜0.05），并且隨著乙酸添加量的增加氨態氮/總氮有降低趨勢。隨著青貯時間的延長，各組水溶性碳水化合物均呈下降趨勢，并隨著乙酸添加量的增加有提高趨勢，各處理組高于對照組（P＜0.05），其中0.4%乙酸處理組顯示最高的水溶性碳水化合物。

2.5 添加乙酸對開窖后有氧暴露過程中pH值、氨態氮/總氮、乳酸和水溶性碳水化合物含量的影響

在有氧暴露的前10d，pH基本保持穩定（圖1），之后到有氧暴露15d，pH值呈升高趨勢，其中各處理組pH值均低于對照組（P＜0.05），而各處理組間差異不顯著（P＞0.05）。在整個有氧暴露階段乳酸含量整體呈下降趨勢，各處理組均高于對照組（P＜0.05），其中0.4A處理組乳酸含量保持最高。整個有氧暴露階段各組水溶性碳水化合物含量均有不同程度下降，其中對照組10d后顯著下降，0.4%和0.5%乙酸添加組水溶性碳水化合物含量始終高于對照組（P＜0.05）。整個有氧暴露階段氨態氮/總氮值總體變化不大，在有氧暴露5和10d，處理組低于對照組（P＜0.05），而處理組間差異不顯著（P＞0.05），至有氧暴露15d，0.5%乙酸處理組的氨態氮/總氮最低，并顯著（P＜0.05）低于其他組。

表5 添加乙酸制劑對混合青貯過程中氨態氮/總氮、乳酸/乙酸和水溶性碳水化合物含量的影響Table 5 Effect of adding acetic acid on the value of ammonia nitrogen/total nitrogen and lactic acid/acetic acid，and the content of water soluble carbohydrates of mixed silages during ensiling

圖1 有氧暴露過程中不同乙酸添加組pH值、氨態氮/總氮、乳酸和水溶性碳水化合物含量變化Fig.1 Changes of contents of lactic acid and water soluble carbohydrate，pH value and ammonia/total nitrogen of mixed silages adding with acetic acid treatments during aerobic exposure

3 討論

3.1 添加不同水平乙酸對全株燕麥和紫花苜蓿混合青貯發酵品質的影響

有機酸及其鹽類可迅速降低青貯初期的pH值，抑制植物酶和微生物活性，已被作為青貯發酵抑制劑廣泛應用于青貯飼料生產中［9－10］，其中乙酸作為常用的消毒防腐劑，能抑制霉菌、酵母等有害微生物的生長和繁殖，減少對發酵底物的消耗，為乳酸菌的生長繁殖提供良好條件。

本試驗將乙酸添加到全株燕麥和紫花苜蓿混合青貯中，結果顯示青貯30d各組pH值均已降至4.0以下，且之后均維持在穩定狀態，其中乙酸添加組的pH較低，乳酸和水溶性碳水化合物含量較高，這可能是由于添加乙酸抑制了早期好氧性微生物的活性，減少了好氧性微生物與乳酸菌對水溶性碳水化合物的競爭，為乳酸菌節省了底物，產生了更多的乳酸，在青貯結束時有較多的水溶性碳水化合物殘留，進而提高了水溶性碳水化合物的利用效率［11］。Moon［12］研究顯示濃度大于100mmol/L的乙酸鹽即可有效抑制酵母等微生物的生長。張新慧等［13］研究了2種乙酸鹽（雙乙酸鈉和脫氫乙酸鈉）對玉米（Zeamays）青貯的影響，結果顯示將脫氫乙酸鈉加入玉米青貯中抑制了細菌及真菌的活動，較大程度地保留了飼料中水溶性碳水化合物和營養物質。許慶方等［14］研究發現添加0.2%乙酸顯著降低了玉米青貯飼料的pH值，對玉米青貯飼料發酵品質的改善效果優于綠汁發酵液。而本研究中0.3%乙酸添加組pH值低于對照，但高于0.4%和0.5%乙酸添加組，且乳酸含量也低于這二者，而0.5%添加組各時間點乳酸含量均低于0.4%添加組，這可能是由于乙酸添加量不同造成而引起的，表明全株燕麥和紫花苜蓿混合青貯時添加0.3%的乙酸對有害微生物的抑制效果不及0.4%，而添加0.5%乙酸不僅抑制了有害微生物活性，也對乳酸菌活性造成了一定的影響。

Henderson［15］曾報道指出發酵品質良好的青貯飼料氨態氮/總氮應小于80g/kg TN，氨態氮主要由青貯過程中蛋白質和氨基酸降解產生，直接影響青貯飼料的營養價值，是評定青貯飼料優劣的重要指標之一。本試驗青貯60d后對照組略高于此值，而乙酸添加組均低于此值，這與乙酸對微生物的抑制效果有關。有機酸常作為發酵抑制劑應用到青貯飼料生產中，其中Shao等［16］將0.1%山梨酸添加到黑麥草（Loliumperenne）青貯中，發現山梨酸可有效提高青貯發酵品質，高效地抑制了梭菌和其他好氧性微生物的生長。張增欣和邵濤［17］在多花黑麥草（Loliummultiflorum）青貯時添加0.25%丙酸，顯著降低了氨態氮含量，更好地保存青貯飼料的營養價值。

3.2 添加不同水平乙酸對全株燕麥和紫花苜蓿混合青貯飼料有氧穩定性的影響

Wilkinson和Davies［18］指出未解離短鏈脂肪酸以被動運輸的形式進入微生物細胞內部，之后釋放H＋降低內部pH值，從而殺死細胞，抑制真菌等微生物的生長繁殖，而乙酸和丙酸的解離程度低于乳酸，可以有效抑制青貯飼料有氧暴露階段酵母、霉菌和真菌的生長繁殖，因此乙酸和丙酸含量已成為預測青貯有氧穩定性優劣的主要指標之一。青貯窖打開后，厭氧環境被破壞，好氧性微生物開始活躍，對照組pH隨著有氧暴露時間的延長顯著上升，而乙酸添加組間基本保持穩定無顯著變化，各組乳酸和水溶性碳水化合物含量均隨著暴露時間的延長而降低，其中對照組的乳酸和水溶性碳水化合物含量最低，氨態氮/總氮最高，這是由于好氧性微生物對乳酸、水溶性碳水化合物、蛋白質和氨基酸的降解引起，而乙酸可以抑制有氧階段好氧性微生物對營養成分的降解，從而達到保存青貯飼料養分和提高有氧穩定性的目的［19］。Danner［20］研究了乳酸、1，2－丙二醇和乙酸等對全株玉米青貯有氧穩定性的影響，證實乙酸能夠有效抑制好氧性微生物的生長，提高青貯飼料有氧穩定性。

4 結論

從pH、氨態氮、乳酸及水溶性碳水化合物含量等指標的動態變化來看，添加乙酸可以改善燕麥和紫花苜蓿混合青貯發酵品質和有氧穩定性。添加0.4%乙酸對好氧性微生物的抑制效果優于0.3%乙酸添加組，而添加0.5%乙酸盡管抑制了好氧性微生物活性，但對乳酸菌活性也造成了一定的影響。綜上所述，依據研究結果和西藏地區生產實際，將燕麥和紫花苜蓿以7∶3混合青貯，以添加0.4%的乙酸最適宜。

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