絕經后婦女MTHFR基因多態性位點聯合作用與骨質疏松易感性的相關性分析

絕經后骨質疏松癥是指由于絕經后雌激素缺乏而引起的破骨細胞的骨吸收和成骨細胞的骨形成之間不平衡而發生的骨質疏松癥和骨折。國內外有關報道顯示,在>60歲的老年女性中,骨質疏松癥的患病率高達40%～50%,其中約30%～50%的患病女性將經歷骨質疏松相關的骨折,由此帶來的并發癥和巨額醫療費用已使骨質疏松成為全球關注的熱點[1-3]。既往研究顯示,有60%～85%的骨量、50%～75%的骨代謝和25%～35%的骨質疏松癥和骨折的發生取決于遺傳因素[4]。5,10亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase,MTHFR)基因是葉酸代謝通路上參與DNA正常合成和甲基化的重要基因之一,其突變可能會導致絕經后婦女骨密度的異常,發生骨質疏松癥及骨折[5-8]。本研究采用以人群為基礎的病例-對照研究方法,探討MTHFR基因的功能性單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位點(rs1801131 A1298C和rs1801133 C677T)的聯合作用與我國蘇州漢族人群絕經后骨質疏松易感性的關系,進一步闡明絕經后骨質疏松癥的可能分子機制,為今后實施目標明確的個體化防治提供理論基礎和臨床依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采用分層隨機抽樣的方法,收集蘇州市金閶區、相城區、吳中區有常住戶口并長期居住在抽樣點的年齡45～70歲自然絕經婦女,排除有影響骨代謝的疾病及其他需長期治療的嚴重慢性疾病、調查前6月服用過激素類藥物及鈣制劑等影響骨代謝藥物及近6月內有骨折史者。測量骨密度T值(為與同性別年輕人平均值進行比較而得到),T值<-2.5SD為骨質疏松診斷標準,共收集骨質疏松病例92例,平均(60.23±5.26)歲,骨超聲傳導速度(SOS)為(3793.91±80.52)m/s。同時期同地區收集正常對照組169例,年齡45～69歲,平均(58.01±5.70)歲,SOS值為(4043.69±94.10)m/s,與病例組年齡匹配。病例組和對照組均來自漢族人群。

1.2 調查方法 使用統一設計的調查表,分別對病例組和對照組進行流行病學調查,主要詢問內容包括一般人口學特征、月經史、生育史、高血壓等慢性病病史,測量身高、體質量、腰圍、臀圍、血壓等,計算體質量指數(BMI)及腰臀比(WHR)。上述調查和采樣均獲得被調查者同意并簽署知情同意書。調查員經統一培訓合格后,方可參加面訪調查。

1.3 實驗方法 應用以色列Sunlight Medical Ltd公司生產的Omnisense 7000s型骨定量超聲儀測定橈骨遠端SOS反映骨密度。采用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒(杭州愛思進生物技術有限公司)提取DNA。MTHFR功能性SNPs位點的基因型分析采用TaqMan方法。按下列體系加樣(5 μl體系): 0.5 μl DNA模板, 2.5 μl TaqMan?Universal PCR Master Mix、0.25 μl Forward/Reverse Primers 、0.125 μl Probe and 1.25 μl ddH2O。反應條件:2 min 50 ℃、10 min 95 ℃, 15 s 95 ℃, 1 min 60 ℃, 40個循環。利用SDS 2.0軟件(ABI)觀察結果。每塊384孔板包括2個來自同一樣本的陽性對照和2個空白樣本的陰性對照。本研究檢測261份DNA樣本,成功率為100%,抽取5%樣本重復檢測,一致性為100%。引物和探針的序列由南京冀鰲生物技術有限公司合成,見表1。

表1 MTHFR基因SNP位點基因擴增的引物和探針序列

1.4 統計分析 采用Epidata 3.0軟件雙軌錄入全部數據資料,核對無誤后供分析使用。采用統計軟件SAS 9.1.3進行數據的統計分析:χ2檢驗 、student-t檢驗用于分析人口學的基本特征;單因素及多因素Logistic回歸分析計算標準化偏回歸系數(β)、OR值及95%CI;擬合優度χ2檢驗用于對照組的基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗;使用PHASE 2.0軟件進行單倍型分析;應用廣義多因子降維法(GMDR)(GMDR軟件,version 0.7)檢測位點-位點、位點-環境之間的聯合作用。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗 在對照組中,對rs1801131位點(1298A>C)基因型及rs1801133位點(677C>T)基因型的頻率進行遺傳平衡檢驗,結果顯示實際頻數與理論頻數分布的差別均無統計學意義(P>0.05),說明該對照組人群2個位點基因型頻率分布均符合遺傳平衡法則,具有人群代表性。見表2。

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗(n)

2.2 MTHFR基因與骨質疏松的關聯性分析 調整年齡、BMI、WHR及產次后,MTHFR基因rs1801133(C→T)的位點變異與骨質疏松的發生成正關聯。與野生型rs1801133 CC基因型相比,突變純合型rs1801133 TT及CT/TT型可以顯著增加骨質疏松的發生風險[調整OR=2.63,2.37;95%CI=(1.20～5.77),(1.16～4.87)]。經1000次置換檢驗(Permutation test)方法校正后,該位點的基因型頻率分布在病例組與對照組間仍存在統計學差異。rs1801133 C/T的等位基因頻率在病例組和對照組中的差異具有顯著性(P=0.039)。未發現rs1801131的多態性與骨質疏松的發生存在關聯。見表3。

表3 MTHFR基因2個SNPs的基因型及等位基因頻率在病例組和對照組的分布

注:a調整因素為年齡、BMI、WHR及產次;b1000次置換檢驗

2.3 MTHFR基因2個SNPs的單倍型分析 單倍型分析結果表明,與最常見的單倍型CC相比,含野生等位基因rs1801131 A的單倍型AC可以顯著降低絕經后婦女骨質疏松的患病風險[調整OR=0.60;95%CI=(0.39～0.90)]。見表4。

表4 MTHFR基因2個SNPs的單倍型分析及與骨質疏松易感性的關系

注:a多態性堿基順序為5′→3′,多態性位點順序依次為rs1801131, rs1801133;b調整P值;c調整因素為年齡、BMI、WHR及產次

2.4 MTHFR基因2個SNPs的聯合作用分析 將rs1801131、rs1801133依次命名為A1、A2,年齡、BMI、WHR及產次作為環境調整因素,應用GMDR分析2個多態性位點的聯合作用,結果顯示模型A1A2 (rs1801131, rs1801133)為最佳模型(交叉驗證一致性10/10,P=0.0107),提示rs1801131和rs1801133位點在骨質疏松的發病中可能存在聯合作用。見表5。

3 討論

MTHFR基因位于人類染色體1p36.3,cDNA全長約2.2 kb,其編碼基因存在遺傳多態性,其中部分多態性的存在可能導致MTHFR mRNA表達下降或缺失,使其翻譯的蛋白質數量銳減,從而影響該酶的活性及穩定性,不能催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸,引起血漿中5-甲基四氫葉酸的降低和同型半胱氨酸(Hcy)的堆積,使得作為甲基供體的甲硫氨酸合成障礙,最終引起DNA的低甲基化[9]。MTHFR所對應的基因多態性位點從1995年677個位點到1998年1298個位點,前后相繼檢測出了20余個多態性位點,并且這些多態性位點突變基因型的交互作用較單獨作用更為明顯。本研究從分子流行病學角度,探討了MTHFR基因的rs1801131(1298A>C)位點及rs1801133(677C>T)位點聯合作用與絕經后婦女骨質疏松發病風險之間的關系。

表5 GMDR方法分析MTHFR基因2個SNPs聯合作用的模型

3.1 單位點分析 結果表明,rs1801133 TT和CT/TT基因型在病例組和對照組分布的差異具有統計學意義(P<0.05)，并且經過1000次置換檢驗后,其差異仍有統計學意義。與對照組(65.68%)相比,C等位基因頻率在病例組(56.52%)顯著降低(P<0.05)。攜帶rs1801133 TT和CT/TT基因型的個體與攜帶CC基因型者相比較,發生骨質疏松的風險分別增加了2.63和2.37倍[調整OR=2.63,2.37;95%CI=(1.20～5.77),(1.16～4.87)],提示T等位基因突變,可能是發生骨質疏松的危險因素。MTHFR C677T是一個最常見的不耐熱錯義突變,能引起酶的耐熱性及活性改變。該多態性位點存在2種等位基因,即野生型C與突變型T,其基因多態性在不同國家、同一國家不同地區、同一地區不同民族或種族中的分布有顯著性差異[10-12],其與骨質疏松和骨質疏松性骨折易感性的研究結論也不盡相同[7,13-14]。有關MTHFR基因多態性與絕經后婦女骨質疏松癥的關系,最早是由Miyao等[5]學者于2000年首次報道;隨后1項包含1748名丹麥絕經后婦女的研究也證實了MTHFR rs1801133 TT基因型與絕經后婦女的低骨礦鹽密度有關,攜帶rs1801133 TT基因型的婦女骨折的發生率增加[6];Villadsen等[7]也有類似結果。本研究進一步證實了蘇州地區漢族絕經后婦女MTHFR基因C677T位點突變與骨質疏松的發生存在相關性,并提示T等位基因可能是骨質疏松發生的獨立危險因素。

3.2 單倍型分析 本研究中,單位點分析未發現rs1801131(1298A>C)位點突變與絕經后婦女骨質疏松發病風險之間存在相關性。但在單倍型分析中,與最常見的單倍型CC相比,含野生等位基因rs1801131 A的單倍型AC可以顯著降低絕經后婦女骨質疏松的患病風險(P<0.05)。攜帶單倍型AC的個體與攜帶單倍型CC者相比較,發生骨質疏松的風險降低了40%[調整OR=0.60;95%CI=(0.39～0.90)]。以上結果提示,突變型rs1801131 C等位基因可能不是骨質疏松發生的獨立危險因素,但當野生型rs1801131 A與rs1801133 C等位基因同時存在時,可能產生聯合作用降低絕經后婦女骨質疏松發生風險。

3.3 聯合作用分析 為研究MTHFR中2個多態性位點是否存在聯合作用,本研究對rs1801131(1298A>C)及rs1801133(677C>T)位點進一步進行了GMDR分析。結果表明,在調整了年齡、BMI、WHR及產次等環境因素后,模型A1A2 (rs1801131, rs1801133)為最佳模型(交叉驗證一致性10/10,P=0.0107),提示rs1801131和rs1801133位點在骨質疏松的發病中可能存在聯合作用。 A1298C點突變是MTHFR基因另外一種常見突變,位于MTHFR基因第7外顯子C端調節區域,該位點的腺苷酸突變為胞嘧啶,導致酶的活性降低[15]。MTHFR A1298C基因多態與骨質疏松及骨質疏松性骨折的關聯研究不多,研究結論也存在一定爭議[16-17]。既往研究認為該位點多態性對酶活性的影響小于C677T多態性。有流行病學研究表明:當研究婦女擁有相同的MTHFR 677 CC基因型時,MTHFR A1298C的 C等位基因突變也是體內Hcy濃度升高的危險因素[18-19]。本研究中,單位點分析未發現rs1801131(1298A>C)位點突變與絕經后婦女骨質疏松發病風險之間存在相關性,與既往研究結果一致。但在單倍型和GMDR分析中,rs1801131 A等位基因可能與rs1801133 C等位基因產生聯合作用,并可能成為絕經后婦女骨質疏松發生過程中的保護因素。

綜上所述,MTHFR基因多態性與蘇州地區絕經后婦女骨質疏松的發病風險存在明顯關聯,攜帶rs1801133 TT和CT/TT基因型的個體較攜帶rs1801133 CC基因型的個體的發病風險明顯增加;攜帶單倍型AC的個體與攜帶單倍型CC者相比較,發生骨質疏松的風險顯著降低;rs1801131 位點可能與rs1801133位點產生聯合作用,共同影響絕經后婦女骨質疏松的發生風險。

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