蔗糖酶米氏常數測定實驗方法的改進

吳梅芬，王曉崗，許新華

(同濟大學 化學系，上海 200092)

酶催化反應動力學是生物化學和物理化學反應動力學的重要內容[1-3]。酶催化反應機理與均相(多相)催化反應機理有顯著差別，通過實驗比較兩類反應動力學行為的差異，對學生掌握化學反應動力學基本理論和方法非常有益。蔗糖轉化反應實驗是經典的化學反應動力學實驗之一。該反應可以用酸均相催化完成，也可以用蔗糖酶催化完成。在實驗教學中，前者常采用測定溶液旋光度的方法，連續測定反應的動力學曲線，是典型的物理化學實驗方法[4-5]；后者則采用化學淬滅法終止反應，取樣分析獲得初始反應速率值，是典型的生物化學實驗方法[6-7]。由于實驗方法的差異性，學生在進行這兩類實驗時很難相互比較，無法將兩者有機聯系起來，因而不能完整理解和掌握化學反應動力學的相關理論。

1 實驗原理

本文研究開發了一種新的蔗糖酶催化蔗糖轉化反應的實驗體系，采用與均相酸催化蔗糖轉化反應完全相同的實驗技術和實驗方法，連續測量蔗糖溶液在蔗糖酶催化作用下的旋光度的變化，通過數據擬合推算反應的初始速率，然后用米氏方程求算相關酶促反應參數。

根據化學反應動力學理論，酶催化反應機理是Michaelis和Menten應用酶反應過程中形成中間絡合物的學說導出的米氏方程[8-9]。蔗糖酶(E)與底物蔗糖(S)先形成中間化合物(ES)，然后中間化合物再進一步分解為產物葡萄糖(G)和果糖(F)，并釋放出酶(E)。機理如下：

(1)

當反應溫度和酶的總濃度確定時，酶促反應速率可以表示為

(2)

式中KM為米氏常數，rm為最大速率，該方程稱為米氏方程。

采用旋光度法測定反應體系中蔗糖濃度時，反應體系的旋光度與蔗糖濃度的關系為

(3)

(4)

積分后得到

(5)

從原理上說，按上式直接擬合實驗測定的t-θ數據就可以得到酶促反應參數KM和rm。但是，由于實驗數據的不完備性、波動性以及酶制劑的質量問題，t-θ關系式中的擬合參數可能無法與上式中相關項的定義一一對應。一般地，可以把實驗測定的t-θ關系表達為如下的普遍形式：

t=A(1-θ)-Blnθ

(6)

經過數據擬合，可以得到擬合參數A、B，并計算出蔗糖初始濃度為cS0時的初始反應速率為

(7)

實驗時，配制一系列不同初始濃度cS0的蔗糖溶液，并測得其α0和α∞。在相同實驗溫度和酶濃度條件下，分別測定每個溶液的反應時間t和旋光度αt數據，并計算出θ值。擬合t-θ關系得到擬合參數A、B，并計算每個溶液的初始反應速率r0，由此得到一系列cS0-r0數據，代入米氏方程中。根據Hanes-Woolf作圖法[10-11]，米氏方程可以變形為

(8)

該實驗方法簡便、實用，物理化學概念清晰明了，實驗技術也是學生熟練掌握的旋光度測定法，實驗數據與酸催化蔗糖轉化反應的實驗結果對照性很強，有助于學生通過對比更好地理解掌握酶催化反應的特點和規律。

2 實驗

2.1 實驗儀器及試劑

電子天平、恒溫水浴、錐形瓶(100 mL)、移液管(5 mL、10 mL、25mL)、pH計、離心機、離心管、超級恒溫槽、旋光儀、旋光管(帶夾套)、玻璃漏斗、定性濾紙、烘箱、鮮酵母、蔗糖(A.R.)、果糖(A.R.)、葡萄糖(A.R.)、醋酸鈉(A.R.)、甲苯(A.R.)、醋酸(A.R.)、具塞碘量瓶(100 mL)、

2.2 實驗步驟

(1) 蔗糖酶的制取[12]：取鮮酵母20 g于100 mL三角瓶中，加入1.6 g醋酸鈉，攪拌15～20 min后使團塊液化，再加3 mL甲苯，混和后搖動10 min，放在恒溫水浴中37 ℃保溫60 h左右；取出后加入3.2 mL、4 mol/dm3的醋酸和100 mL水，使pH值在4.5左右；將混合物以3 000 r/min的速度離心30 min，離心后形成3層，取中層的黃色液體；再以同樣速度離心30 min，所得澄清的黃色液體即為蔗糖酶粗品；將此蔗糖酶用pH=4.6的緩沖溶液稀釋10倍，過濾后冷凍保存。

(4) 蔗糖酶催化過程中不同蔗糖濃度體系的旋光度變化值測定：取0.6 mol/dm3的蔗糖25 mL溶液于50 mL容量瓶中，再加入22 mL、pH=4.6的緩沖溶液，加入10 mL自制粗蔗糖酶，再稀釋至刻度線，得到蔗糖濃度為0.3 mol/dm3的蔗糖酶催化反應溶液；移入帶夾套旋光管，在35 ℃恒溫條件下測定溶液旋光度隨時間t的變化t；然后采用同樣的方法，分別取0.6 mol/dm3的蔗糖溶液12.5 mL、10 mL、7 mL、5 mL和4 mL，配制得到濃度為0.048～0.15 mol/dm3的蔗糖酶蔗糖反應液，并分別測定其t。

2.3 數據記錄與處理

(1) 蔗糖溶液濃度cs與0、關系。采用蔗糖配制一系列標準溶液，并測定其旋光度0；采用葡萄糖與果糖配制成1∶1的一系列標準濃度，并測定其旋光度，并將濃度與對應的旋光度作圖，得到直線的線性很好結果，如圖1所示。

圖1 蔗糖溶液濃度cs與0、值關系曲線(35 ℃)

(2) 在35 ℃恒溫下測定0.3 mol/dm3的蔗糖溶液在蔗糖酶作用下，溶液的t～t的關系數據。以θ為橫坐標，t為縱坐標作圖，用Origin軟件按方程(6)作非線性擬合，得到擬合參數A、B值(見圖2)。

圖2 蔗糖酶催化過程中旋光度隨時間變化關系

按同樣方法作圖計算得到一系列不同蔗糖初始濃度cs0對應的A、B值，并列于表1中。按方程(7)計算每個cs0對應的初始反應速率r0值。

表1 不同初始濃度蔗糖溶液的初始反應速率及擬合參數

將上述數據采用式(8)擬合直線，直線斜率為1/rm，在縱軸上截距為KM/rm，直線延伸于橫軸交點為KM(見圖3)。實驗測得35 ℃時本實驗使用的粗制蔗糖酶的米氏常數KM=0.029 mol/dm3，最大速率rm=1.3010-4mol/(dm3·s)，與文獻值相符[12-13]。

圖3 Hanes-Woolf作圖法計算米氏常數

3 結果與討論

本實驗采用旋光儀對酶催化蔗糖轉化反應體系中溶液的旋光度進行連續測定，使用的實驗儀器與方法同酸催化蔗糖轉化反應實驗類似，有利于學生將傳統物理化學實驗與生物化學實驗的概念、方法和技術進行對比，加深對酶催化反應特點的認識。本實驗適用于粗制蔗糖酶作為催化劑的酶催化反應動力學研究，所采用的數據處理方法能夠有效消除干擾因素(如：酶制劑不純等)對實驗結果的影響，使用常規的物理化學儀器，用比較嚴密的實驗方法獲得酶催化反應的初始反應速率數據，比較正確地描述了酶催化反應動力學方程，并得到了與文獻報道相近的動力學參數。

本實驗方法簡便、準確、適用于大規模本科生物理化學實驗教學，實驗所使用的試劑和儀器價廉、易得、安全，有效填補了常規物理化學實驗中酶催化動力學實驗項目的缺失，使學生獲得更全面的物理化學實驗訓練，加深對物理化學基本原理和方法的理解和掌握。該實驗體系在我校化學、材料等專業的實驗教學中取得了良好的教學效果。

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