基于UFLC-Q-TOF-MS/MS技術的鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片雜質的研究*

黃 昕，張 超，周翠蘭，鄒 威，蘇薇薇，彭 維

(1.中山大學生命科學學院，廣東 廣州510275；2.廣州一品紅制藥有限公司，廣東 廣州510760)

鹽酸克林霉素棕櫚酸酯，化學名為6-(1-甲基-反-4-丙基-L-2-吡咯烷甲酰氨基)-1-硫代-7(S)-氯-6,7,8三脫氧-L-蘇氏-α-D-半乳辛吡喃糖苷-2-棕櫚酸酯鹽酸鹽，是克林霉素的衍生物，體外無抗菌活性，在體內經酯酶水解形成克林霉素而發揮抗菌活性[1]。其在合成過程中會產生一些副產物及降解產物，產生的雜質會導致其抗菌活性降低、毒性增加，影響臨床使用效果[2]。因此，有必要對這些雜質進行鑒定和控制。

目前對于鹽酸克林霉素棕櫚酸酯雜質的研究，主要采用高效液相色譜法(HPLC-UV)和液質聯用技術(LC-MS)[1-3]。其中液質聯用技術結合了色譜強大的分離能力與質譜優越的定性功能，對藥物雜質分析具有無可比擬的優越性。Bharathi等[3]首次分離鑒定了鹽酸克林霉素棕櫚酸酯中的10種雜質，王建等[2]采用HPLC-ESI-MSn法鑒定了國產鹽酸克林霉素棕櫚酸酯原料藥中的3個新雜質。但是，由于藥物中某些雜質含量極低，迫切需要一種更靈敏、更精確的手段對其進行檢測，以確保藥物的安全性。目前新一代的超快速高效液相色譜串聯時間飛行質譜技術(UFLC-Q-TOF-MS/MS)，集快速有效的分離能力和高分辨、高質量精度的定性能力為一體，已成為研究微量藥物雜質的最有效手段之一[4]，筆者采用該技術對鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片中的雜質進行了鑒定，共檢出16種雜質，其中4種雜質為首次檢出。本研究對確保藥品安全性、質量可控性具有重要意義，為國內藥品質量控制提供了示范。

1 儀器與試藥

超快速高效液相色譜儀(LC-20AD-XR二元泵，SIL-20AD-XR自動進樣器，CTO-20A柱溫箱，日本島津公司)；四級桿-飛行時間質譜儀(AB SCIEX Triple TOF 5600，美國應用生物系統公司)；超純水系統(Simplicity SIMS00000，美國密理博公司)。

鹽酸克林霉素棕櫚酸酯對照品(CAT. NO. 1137005 USP ROCKVILLE，MD LOT H01037，以克林霉素計含595 μg/mg或w=59.5%)；克林霉素B棕櫚酸酯對照品(浙江海翔藥業股份有限公司，批號101025)；鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片(規格75 mg/片，廣州一品紅制藥有限公司，批號20130301，20130302，20130303)；甲醇(色譜純，Burdick & Jackson)、乙腈(光譜純，Burdick & Jackson)、醋酸銨(HPLC級，Fluka，17836-50G)。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片細粉適量，加甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含克林霉素0.57 mg溶液，濾過，作為供試品溶液；取鹽酸克林霉素棕櫚酸酯對照品，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋成每1 mL中含克林霉素2.22 mg的溶液，作為對照品溶液。取克林霉素B棕櫚酸酯對照品，精密稱定，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋成每1 mL中含克林霉素0.50 mg的溶液，作為雜質對照品溶液。

2.2 液相色譜分析條件[2]

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8(3×150 mm, 3.5 μm)，流動相A為5 mmol/L醋酸銨溶液-乙腈(體積比為50∶50)，流動相B為乙腈(洗脫梯度見表1)，流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫條件Table 1 HPLC mobile phase gradient elution conditions

2.3 質譜條件

選用ESI作為電離源。采用正離子模式同時進行一級和二級掃描。離子噴霧電壓：1 500 V；離子源氣體：60 psi；離子源溫度：550 ℃；碰撞器壓力：8 psi。檢測結果見表2。

表2 鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片中的雜質Table 2 Impurities in clindamycin palmitate hydrochloride dispersible tablets

2.4 雜質解析

雜質1：準分子離子峰[M+H]+為m/z425.187 2。對其進行子離子解析，m/z377.183 1推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH產生，m/z126.127 6為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為(圖1)和參考文獻[2-3]，故鑒定該化合物為克林霉素，分子式為C18H33ClN2O5S。

圖1 克林霉素正模式下一級掃描圖(a)、二級碎片質譜圖(b)及斷裂途徑(c)Fig.1 (a)MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of clindamycin, and (c) the mass fragmentation pathways

雜質2：準分子離子峰[M+H]+為m/z465.218 0。對其進行子離子解析，m/z417.218 7推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.127 4為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為(圖2)和參考文獻[2]，故鑒定該化合物為丙叉克林霉素，分子式為C21H37ClN2O5S。

雜質3：準分子離子峰[M+H]+為m/z565.307 3。對其進行子離子解析，m/z517.324 8推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.128 9為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素九酸酯，分子式為C27H49ClN2O6S。

雜質4：準分子離子峰[M+H]+為m/z579.322 9。對其進行子離子解析，m/z531.320 7推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.126 8為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素十酸酯，分子式為C28H51ClN2O6S。

圖2 丙叉克林霉素正模式下一級掃描圖(a)、二級碎片質譜圖(b)及斷裂途徑(c)Fig.2 (a)MS and (b) MS/MS in positive mode of anisylidene clindamycin， and (c) the mass fragmentation pathways

雜質5：準分子離子峰[M+H]+為m/z679.411 7。對其進行子離子解析，m/z615.411 8推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SOH 產生，m/z126.127 7為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為(圖3)和參考文獻[2]，故鑒定該化合物為亞砜克林霉素棕櫚酸酯，分子式為C34H63ClN2O7S。

雜質6：準分子離子峰[M+H]+為m/z593.338 6。對其進行子離子解析，m/z545.333 1推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.128 4為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素十一酸酯，分子式為C29H53ClN2O6S。

圖3 亞砜克林霉素棕櫚酸酯正模式下一級掃描圖(a)、二級碎片質譜圖(b)及斷裂途經(c)Fig.3 (a)MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of sulfoxides clindamycin palmitate hydrochloride and (c) the mass fragmentation pathways

雜質7：準分子離子峰[M+H]+為m/z645.450 7。對其進行子離子解析，m/z597.448 3推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.128 0為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為(圖4)和參考文獻[3]，故可鑒定該化合物為林可霉素棕櫚酸酯，分子式為C34H64N2O7S。

圖4 林可霉素棕櫚酸酯正模式下一級掃描圖(a)、二級碎片質譜圖(b)及斷裂途徑(c)Fig.4 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of Lincomycin palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

雜質8：準分子離子峰[M+H]+為m/z607.354 2。對其進行子離子解析，m/z559.350 5推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.127 7為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2]，故可鑒定該化合物為克林霉素十二酸酯，分子式為C30H55ClN2O6S。

雜質9：準分子離子峰[M+H]+為m/z621.369 9。對其進行子離子解析，m/z573.365 3推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.128 1為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2]，故可鑒定該化合物為克林霉素十三酸酯，分子式為C31H57ClN2O6S。

圖5 棕櫚酸乙酯正模式下一級掃描圖(a)、二級碎片質譜圖(b)及斷裂途徑(c)Fig.5 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of ethyl palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

圖6 克林霉素B棕櫚酸酯正模式下一級掃描圖(a)、二級碎片質譜圖(b) 及斷裂途徑(c)Fig.6 (a) MS and (b) MS/MS spectra in positive mode of ethyl palmitate, and (c) the mass fragmentation pathways

雜質11：準分子離子峰[M+H]+為m/z635.385 5。對其進行子離子解析，m/z587.388 1推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.127 8為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2]，故可鑒定該化合物為克林霉素十四酸酯，分子式為C32H59ClN2O6S。

雜質12：準分子離子峰[M+H]+為m/z663.416 8。對其進行子離子解析，m/z615.411 7推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.127 8為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素棕櫚酸酯異構體，分子式為C34H63ClN2O6S。

雜質13：準分子離子峰[M+H]+為m/z649.401 2。對其進行子離子解析，m/z601.394 1推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z112.111 5為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C7H3N]+。該化合物的保留時間、精確相對分子質量、質譜行為(圖6)與對照品一致[2-3] ，故可鑒定該化合物為克林霉素B棕櫚酸酯，分子式為C33H61ClN2O6S。

雜質14：準分子離子峰[M+H]+為m/z677.432 5。對其進行子離子解析，m/z629.429 6,推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.127 8為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素十七酸酯，分子式為C35H65ClN2O6S。

雜質15：準分子離子峰[M+H]+為m/z691.448 1。對其進行子離子解析，m/z643.445 1推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.128 2為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2-3]，故可鑒定該化合物為克林霉素十八酸酯，分子式為C36H67ClN2O6S。

雜質16：分子離子峰[M+H]+為m/z703.448 1。對其進行子離子解析，m/z655.329 6推測為準分子離子峰經裂解脫去1個中性分子CH3SH 產生，m/z126.128 1為克林霉素吡咯環的特征碎片離子[C8H5N]+。根據該化合物的精確相對分子質量、質譜行為和參考文獻[2]，故可鑒定該化合物為丙叉克林霉素棕櫚酸酯，分子式為C37H67ClN2O6S。

3 討 論

在本研究中，檢測出鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片中的16種雜質，其中克林霉素九酸酯、克林霉素十酸酯、克林霉素十一酸酯、克林霉素十三酸酯為首次檢到。經二級質譜分析指認，所檢測到的雜質均為脂肪酸類物質或克林霉素與脂肪酸的結合物，他們是鹽酸克林霉素棕櫚酸酯合成過程中所產生的副產物，在產品的質量控制中，必須對其進行監控。

本文采用UFLC-Q-TOF-MS/MS技術對鹽酸克林霉素棕櫚酸酯分散片中的雜質進行鑒定，將液相色譜的高效在線分離能力與質譜的高選擇性、高靈敏度的檢測能力相結合，具有分辨率高、靈敏度高、分析時間短的特點[5-7]，能檢測到更多的雜質，為進一步加強藥品生產工藝過程的質量控制提供了依據。在有關物質的分離與鑒定中，具有巨大的優越性，值得推廣應用。

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