中國南方沿海13種石斑魚類的分子系統進化關系分析*

陳興漢，郭 梁，李明明，蒙子寧，林浩然

(1. 陽江職業技術學院生命科學與技術系，廣東 陽江 529566；2. 中山大學水生經濟動物研究所暨廣東省水生經濟動物良種繁育重點實驗室，廣東 廣州 510275)

石斑魚類在分類學上隸屬于鱸形目(Perciformes)、鱸亞目(Percoidei)、鮨科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)。俗稱的石斑魚是石斑魚亞科魚類的統稱。石斑魚除少數種類生活在河口，多數棲息于熱帶或亞熱帶的珊瑚礁水域，主要以小型魚類、底棲甲殼類和頭足類等為食，是珊瑚礁生態系統的主要掠食者[1]。石斑魚為世界性名貴海產經濟魚類，也是我國南方沿海省份(廣東、海南、福建、廣西)重要的海水增養殖對象。然而近年來受過度捕撈、養殖群體近親繁殖、珊瑚礁破壞、海洋環境污染等因素影響，加之石斑魚本身有性逆轉的特性，致使資源日漸衰退，部分種類已被國際自然保護聯盟(IUCN, International Union for Conservation of Nature)列為瀕危或近危[2]。

石斑魚除資源狀況堪憂外，還存在著種類鑒定上的難題[3]。石斑魚的種類較多，全世界范圍內已記錄的有100多種，我國已記錄的有50多種。石斑魚的種類鑒定通常是根據體色、身體和頭部形態、鰭的結構和數量[1]，而進一步的系統進化研究則主要是依據一些骨學特征以及幼體發育過程中仔魚的形態特征[4-7]。然而，由于石斑魚種類繁多、形態特征類似且體色和斑紋多變，因此，僅依據這些形態特征往往難以準確的鑒別，并導致了石斑魚分類學上的混淆以及重建進化關系研究上的困難，至今石斑魚的分類依然是魚類分類學的難題。目前依據Nelson[8]的魚類分類系統，將鮨科分為鮨亞科、花鱸亞科和石斑魚亞科3個亞科，共63屬449種。其中石斑魚亞科又可細分為5個族：石斑魚族、東洋鱸族、鱸族、長鱸族和黃魚族。

近年來分子生物學的快速發展，使得在分子水平上進行魚類的分類鑒定和系統進化研究成為現實。分子系統學(Molecular Phylogeny)通過檢測生物大分子的遺傳信息，因其含有信息量大，且趨同效應弱，因而其結論相對于經典的形態系統分類更具客觀性和可比性。其中線粒體DNA由于其結構簡單、無重組、多數母性遺傳等特點，已成為群體遺傳分析和系統進化研究的有力工具[9-11]。線粒體特定基因序列分析，已經成功的應用于許多種魚類系統進化的研究，如圓罩魚(Cyclothone)、南乳魚(Galaxias)、突吻鱈(Coryphaenoides)等[12-14]。Craig等[15]最先研究報道了南北美洲42種石斑魚類的分子系統進化關系。國內學者僅見丁少雄等[16]針對中國近海30種石斑魚類，進行了基于16S rDNA的分子系統進化研究。

文章中應用線粒體細胞色素b基因(Cyt b)以及兩個核糖體RNA基因(16S和12S)序列對中國近海石斑魚亞科的3個屬：石斑魚屬(Epinephelus)、九棘鱸屬(Cephalopholis)和鰓棘鱸屬(Plectropomus)共13個種的種類鑒定及親緣關系進行分析，采用了線粒體基因組不同區域的多組序列數據(Cyt b、16S rRNA、12S rRNA)的聯合分析，聯合構建系統進化樹，以探討石斑魚類的分子系統進化關系。

1 材料和方法

1.1 材料

文章中的石斑魚亞科3個屬13個種共61個個體為采自中國南方沿海省份廣東(廣州、深圳、珠海、惠州、湛江)和海南(海口)沿海的科研基地、養殖場和鮮魚市場(見表1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 剪取魚體尾部組織約50 mg，參照Sambrook等[17]方法進行基因組DNA提取。

1.2.2 線粒體Cyt b、16S rRNA以及12S rRNA基因擴增及測序 所用引物序列見表2(上海生工合成)。PCR反應總體積為25 μL，包括2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.2 μmol/L每種引物，1 U Taq plus DNA聚合酶(MBI)，1×Taq 聚合酶緩沖液以及30 ng基因組DNA。反應條件為94 ℃預變性2 min后經過30個循環，每個循環包括94 ℃ 45 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用UNIQ-5(上海生工)柱式純化試劑盒純化后，在ABI377型自動測序儀(PE)上進行雙向測序。

1.2.3 序列分析 采用DNAStar軟件中的SeqMan程序對測序所得到的正向序列和反向序列進行拼接，使用Clustalx1.8進行對位排序，應用Genedoc軟件進行人工校正。用DNASP3.51軟件計算變異位點、簡約信息位點數、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數、種間平均每位點核苷酸替代數。

表1 樣品來源Table1 Origin of the samples

表2 引物及其序列Table 2 Primers and their sequences

1.2.4 聚類分析 利用MEGA3.1軟件并根據Kimura雙參數模型計算遺傳距離，對3段基因序列分別構建鄰接(Neighbor-joining，NJ)和最大簡約(Maximum-parsimony，MP)系統樹，之后用3段基因序列的聯合基因序列(Combined genes)構建 NJ 和 MP 系統樹，采用Bootstrap1000檢驗分枝的置信值。

2 結 果

2.1 序列及變異

測序所得13種石斑魚類的Cyt b基因片段長423 bp，無插入和缺失，轉換/顛換之比為 2.5。共存在25種單倍型序列，序列間共有153個變異位點，其中簡約信息位點139個。核苷酸多樣性指數為0.14，平均核苷酸差異數達59.84(表3)。從種內變異來看，序列差異較小。青石斑魚、黑邊石斑魚、鮭點石斑魚、布氏石斑魚、棕斑石斑魚和斑鰓棘鱸種內序列相同，其余石斑魚種內存在變異位點1～8個(表4)。

去除7個插入/缺失，測序所得13種石斑魚類的16S rRNA基因片段長592 bp，轉換/顛換之比為 2.2。共存在21種單倍型序列，序列間共有139個變異位點，其中簡約信息位點119個。核苷酸多樣性指數為0.08，平均核苷酸差異數達46.62(表3)。種內序列差異較小，青石斑魚、鮭點石斑魚、布氏石斑魚、棕斑石斑魚、紅九棘鱸和斑鰓棘鱸種內序列相同，其余石斑魚種內存在變異位點1～3個(表4)。

13種石斑魚類的12S rRNA基因片段存在5個插入/缺失，去除后為434 bp，轉換/顛換之比為 2.2。共存在14種單倍型序列，序列間共有87個變異位點，其中簡約信息位點70個。核苷酸多樣性指數為0.08，平均核苷酸差異數達34.74(表3)。種內變異極小(變異位點1個、單倍型序列14種)，除豹紋鰓棘鱸種內存在1個位點差異外，其余石斑魚種內序列相同(表4)。

表3 13種石斑魚類線粒體基因序列的遺傳信息指數Table 3 Genetic informative indices of the mitochondrial genes of 13 Epinepheline species

表4 13種石斑魚類的種內遺傳差異Table 4 Intraspecies genetic variations of 13 Epinepheline species

2.2 聚類分析

從屬水平來看，線粒體3個基因以及聯合基因序列計算的遺傳距離均為石斑魚屬與九棘鱸屬的最小，與鰓棘鱸屬的最大，表明石斑魚屬與九棘鱸屬有較近的親緣關系(表5)。

從種水平來看，不同基因序列得出的種間遺傳距離不同：13種石斑魚類種間遺傳距離最大的分別為黑邊石斑魚與斑鰓棘鱸(Cyt b、聯合基因)、棕斑石斑魚與斑鰓棘鱸(16S)、鮭點石斑魚與斑鰓棘鱸(12S)；最小的分別為豹紋鰓棘鱸與斑鰓棘鱸(Cyt b、12S、聯合基因)、赤點石斑魚與青石斑魚(16S)(表6)。

另一方面，就石斑魚屬9個種而言，遺傳距離最大的為鞍帶石斑魚與青石斑魚(Cyt b)、鞍帶石斑魚與黑邊石斑魚(16S、聯合基因)、褐點石斑魚與黑邊石斑魚(12S)；遺傳距離最小的均為赤點石斑魚與青石斑魚。

根據線粒體Cyt b基因序列構建NJ和MP系統樹(圖1)，均表明13種石斑魚類分別按所屬的石斑魚屬、九棘鱸屬和鰓棘鱸屬各自聚類，形成3個單系的聚類群。石斑魚屬與九棘鱸屬親緣關系較近，首先聚類；鰓棘鱸處于系統樹的最基部。在NJ系統樹，石斑魚屬形成兩個聚類群(為方便描述起見，簡稱為A群和B群)，A群由赤點石斑魚、青石斑魚、黑邊石斑魚、蜂巢石斑魚、鮭點石斑魚以及布氏石斑魚組成，B群則包含褐點石斑魚、鞍帶石斑魚、斜帶石斑魚以及棕斑石斑魚。MP系統樹支持了B群的聚類，而A群中的種類則表現為階梯式的姐妹枝。在兩種系統樹中，兩兩相聚且有相對較高的置信值(>50)有：赤點石斑魚和青石斑魚、蜂巢石斑魚與鮭點石斑魚、斜帶石斑魚與棕斑石斑魚，表明它們具有較近的親緣關系。

表5 13種石斑魚類屬間的遺傳距離Table 5 Intergeneric genetic distance of 13 Epinepheline species

a．Intergeneric genetic distance——Cyt b

ECPE―――C0.10577―――P0.164280.16270―――

b．Intergeneric genetic distance——16S

ECPE―――C0.06768―――P0.141620.11340―――

c．Intergeneric genetic distance——12S

ECPE―――C0.11570―――P0.176400.15820―――

d．Intergeneric genetic distance——combined genes

(注: E=Epinephelus，C=Cephalopholis，P=Plectropomus)

表6 13種石斑魚類種間的遺傳距離Table 6 Interspecies genetic distance of 13 Epinepheline species

a．Interspecies genetic distance——Cyt b

種名E.lanceolatusE.corallicolaE.fuscoguttatusE.merraE.longispinisE.akaaraE.awoaraE.fasciatusE.bleekeriE.coioidesC.sonneratiP.leopardusE.lanceolatus―――E.corallicola0.03843―――E.fuscoguttatus0.045680.02937―――E.merra0.071780.054810.06021―――E.longispinis0.062320.049180.056540.02589―――E.akaara0.056750.040100.045510.029480.02412―――E.awoara0.058720.043790.047400.031230.029480.01022―――E.fasciatus0.081510.067860.067770.062320.051150.043850.04208―――E.bleekeri0.060360.049130.049080.045560.040140.029400.034820.05683―――E.coioides0.047590.031270.040140.047290.040060.031120.029370.058410.04729―――C.sonnerati0.106410.102480.096150.114470.110490.098450.098570.125210.098240.10046―――P.leopardus0.154740.170370.159110.170030.165420.170030.167960.174520.161460.158960.16163―――

b．Interspecies genetic distance——16S

種名E.awoaraE.akaaraE.bleekeriE.fasciatusE.merraE.longispinisE.fuscoguttatusE.coioidesE.lanceolatusE.corallicolaC.sonneratiP.leopardusE.awoara―――E.akaara0.01871―――E.bleekeri0.050470.03813―――E.fasciatus0.050310.040470.05031―――E.merra0.037940.028280.043020.04525―――E.longispinis0.057900.047950.058100.055210.02354―――E.fuscoguttatus0.073730.063250.076080.086470.076230.07874―――E.coioides0.070820.065610.078470.078230.068100.067990.03320―――E.lanceolatus0.078600.068100.080990.078130.075830.075710.040530.03560―――E.corallicola0.073320.065510.078340.070490.073200.073090.038060.028280.02833―――C.sonnerati0.080990.075710.083650.083200.078230.086060.052910.047870.042820.04531―――P.leopardus0.149610.140370.158130.151350.157470.163260.117900.129200.117770.123370.11248―――

c．Interspecies genetic distance——12S

種名E.lanceolatusE.fuscoguttatusE.coioidesE.corallicolaE.akaaraE.awoaraE.fasciatusE.bleekeriE.merraE.longispinisC.sonneratiP.leopardusE.lanceolatus―――E.fuscoguttatus0.06490―――E.coioides0.070370.06183―――E.corallicola0.065090.058080.05050―――E.akaara0.088420.072570.074070.08216―――E.awoara0.100740.078910.070930.087000.03783―――E.fasciatus0.109940.099410.100230.097810.079660.07561―――E.bleekeri0.090610.077910.085010.083530.058850.065750.08362―――E.merra0.100450.081260.080210.093360.059550.062500.089090.06720―――E.longispinis0.090610.078070.083400.079540.062570.075020.085140.068760.04832―――C.sonnerati0.111000.102780.105420.111290.115280.114440.141490.111780.122630.12093―――P.leopardus0.162540.158470.165420.167420.179860.178300.183020.172700.182300.183090.15330―――

d．Intergeneric genetic distance——combined genes

圖1 基于13種石斑魚類Cyt b基因序列的NJ和MP系統樹Fig.1 NJ and MP phylogenetic trees based on Cyt b gene sequences of 13 Epinepheline species

基于16S和12S rRNA基因序列構建的NJ和MP系統樹(圖2，3)的拓撲結構與線粒體Cyt b基因的相似，如13個種各自按所屬聚類形成3個單系群，三個屬在系統樹所處的位置以及石斑魚屬形成的兩個聚類群等。不同之處在于石斑魚屬中一些種所處的位置，如在16S-NJ系統樹中，斜帶石斑魚與A群相聚(而在Cyt b/12S-NJ系統樹中斜帶石斑魚歸類于B群)；此外16S和12S-MP系統樹支持的是A群的聚類，而B群中的種類則表現為階梯式的姐妹枝；16S和12S系統樹均不支持斜帶石斑魚與棕斑石斑魚具有較近的親緣關系。

圖3 基于13種石斑魚類12S rRNA基因序列的NJ和MP系統樹Fig.3 NJ and MP phylogenetic trees based on 12S rRNA gene sequences of 13 Epinepheline species

相比較與上述單個基因所構建的系統樹，聯合基因序列的系統樹明顯具有更好的一致性(NJ和MP的拓撲結構基本一致)和更高的置信度(系統樹分枝的置信值高)(圖4)。聯合基因系統樹不僅支持13個種各自按所屬聚類形成3個單系群以及3個屬在系統樹所處的位置，而且以極高的置信值(100)支持石斑魚屬的兩個聚類群。此外它還支持了Cyt b系統樹分析得到的赤點石斑魚和青石斑魚、蜂巢石斑魚與鮭點石斑魚、斜帶石斑魚與棕斑石斑魚具有較近的親緣關系的結論。

圖4 基于13種石斑魚類聯合基因序列的NJ和MP系統樹Fig.4 NJ and MP phylogenetic trees based on combined gene sequences of 13 Epinepheline species

3 討 論

3.1 線粒體基因序列變異與石斑魚類的種類鑒定

準確鑒定石斑魚類的種類是進一步研究其分類關系和系統演化過程的基礎；在生產實踐中，對石斑魚類的產品交易、魚類自然資源的保護和利用也有著重要的意義。魚類分類學家Heemstra和Randall[1]在編著的《Groupers of the world》引言的第一段即指出：“準確種類鑒定的重要性對于每一個生物學家是顯而易見的，將得到養殖者和分類學家的重視，同時對正確管理該物種的漁業資源也極為重要”。然而，由于石斑魚類的種類繁多、形態類似、體色易變等，使得基于形態特征的傳統種類鑒定較為復雜困難，并出現了許多鑒定錯誤的事例。分子標記(如線粒體基因序列)反映的是物種內在的遺傳差異，不受外在形態的影響，故已經成為魚類種類鑒定的有力工具[18-19]。

文章中對13種石斑魚類的線粒體Cyt b、16S rRNA以及12S rRNA基因的部分片段進行了擴增和測序，結果表明：石斑魚類種間基因序列存在較大的變異，如Cyt b基因片段的變異位點高達153個，更為保守的rRNA基因也存在139(16S)和88(12S)個變異位點；另一方面，13種石斑魚類種內基因序列的變異較小，在Cyt b和16S rRNA基因中均有近半數(6～7種)石斑魚類種內序列完全相同，而其余種類通常只有1～3個變異位點。12S rRNA基因種內變異極小，除一種石斑魚(豹紋鰓棘鱸)種內存在1個位點差異外，其余石斑魚種內序列相同。顯然，種間較大的遺傳差異以及極小的種內變異使得這些線粒體基因十分適合用于石斑魚類的鑒定。通過線粒體基因的變異位點，就可以非常準確的鑒別這13種石斑魚類。

通過計算變異位點數、簡約信息位點數、核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數等遺傳信息指數，可知12S基因的保守性最大，16S次之，而Cyt b基因保守性最小。Cyt b基因相對較小的保守性使其能提供更多用于種類鑒定的變異位點，因而作為鑒定標記較rRNA基因更為準確。但這并不表明保守性越小的基因就更適合用于石斑魚類的種類鑒定。

3.2 13種石斑魚類的系統進化及親緣關系分析

近年來，許多魚類學者已經從單純的分類區系研究轉向魚類系統進化方面。他們綜合利用形態學、生物化學、分子生物學等方法來辨別和分析祖征和離征，藉以探求魚類系譜，探索共同起源，真正反映出彼此間的親緣關系[20]。

文章中根據所測定的13種石斑魚類的線粒體Cyt b、16S rRNA以及12S rRNA基因的部分片段，計算遺傳距離并構建NJ和MP系統樹進行親緣關系分析。結果表明，3個基因構建的系統樹拓撲結構大體一致，如石斑魚屬、九棘鱸屬和鰓棘鱸屬在系統樹所處的位置以及石斑魚屬形成的兩個聚類群等。但在石斑魚屬中，一些種類在系統樹中所處的位置隨基因的不同或建樹方法的不同而改變，且分枝節點的置信值較低。

單個基因(特別是保守性較高的基因)能提供的遺傳信息往往較為有限[21]。在無其它背景資料的情況下，為了獲得較為客觀的系統樹，不少學者主張線粒體基因組不同區域的多組序列數據的聯合分析[22]。Miller 等[23]研究發現，多基因聯合比單獨進行分析得到的系統樹分辨率及置信值更高，且被形態性狀所支持，即使基因間的進化速率差異較大。隨后更多研究發現同樣現象，支持了將同一樣本所有具有系統發育信息的基因合并在一起進行分析，可以獲得更真實系統進化關系[24-25]。

文章中將所測序的線粒體3個基因進行聯合分析。相比較單個基因，聯合基因序列構建的系統樹明顯具有更好的一致性(NJ和MP的拓撲結構基本一致)和更高的置信度(系統樹分枝的置信值高)。結合本文的結果與上述其他學者的研究結果，作者認為基因聯合分析所得到的石斑魚類系統進化關系可信度更高，現描述如下：13種石斑魚類分別按所屬的石斑魚屬、九棘鱸屬和鰓棘鱸屬各自聚類，形成3個單系的聚類群。石斑魚屬與九棘鱸屬親緣關系較近，首先聚類。石斑魚屬處于系統樹的頂端，表明其最近分化的進化地位；鰓棘鱸處于系統樹的最基部，表明其為較為原始的種類。石斑魚屬形成兩個聚類群，一枝由赤點石斑魚、青石斑魚、黑邊石斑魚、蜂巢石斑魚、鮭點石斑魚以及布氏石斑魚組成，另一枝則包含褐點石斑魚、鞍帶石斑魚、斜帶石斑魚以及棕斑石斑魚。其中，赤點石斑魚和青石斑魚、蜂巢石斑魚與鮭點石斑魚、斜帶石斑魚與棕斑石斑魚兩兩相聚且有相對較高的置信值，表明它們具有較近的親緣關系。

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