大鼠骨髓間充質干細胞體外誘導分化為心肌樣細胞的研究

顧 健,王愛玲,郝玉瑜,張夢達,孫繼敏

(安徽醫科大學第一附屬醫院心血管內科,合肥230022)

骨髓間充干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有易于獲取、在一定條件下能大量擴增，同時自體移植不存在倫理爭議，也沒有免疫排斥反應且在體內外可誘導分化為內皮細胞、心肌細胞等優勢[1-2]。研究發現，BMSCs在體內、體外誘導環境下，可分化為心肌樣細胞，但其機制尚不明確[3]。本實驗將大鼠BMSCs分別用5-氮胞苷誘導和與心肌細胞共培養的方法進行體外誘導，觀察大鼠BMSCs在不同時間段分化為心肌樣細胞的能力及表達心肌細胞特異性標志物心肌特異性基因肌鈣蛋白I(cardiac-specific troponin I，cTnI)、縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)和心肌特異性轉錄因子4(cardiac-specific transcription factor-4,GATA-4)的差別，為今后進一步研究BMSCs分化機制以及應用于臨床治療缺血性心臟病提供一定的理論依據和技術手段。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠16只，均為4周齡，質量80～120 g。同種新生1～3 d乳鼠40只，雌雄不限，用于分離培養心肌細胞。實驗動物均由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2試劑及儀器 高糖細胞培養液(high glucose dulbecco′s modified eagle medium,H-DMEM)(杭州四季青公司提供)，胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS) (Hy-clone公司提供)，5-氮胞苷、0.25%胰蛋白酶、0.125%胰蛋白酶(美國Sigm公司)，反轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriotion-polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒(Invitrogen)，cTnI、Cx43、GATA-4引物[生工生物工程(上海)有限公司生產，批號依次為ASW10353/4，ASW10351/2,120421L54/5]，兔抗大鼠cTnI單克隆抗體、兔抗大鼠CX43多克隆抗體[生工生物工程(上海)有限公司]，Ⅸ70型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS TOLYO公司)，熒光顯微鏡及攝像成像系統(上海精密科學儀器有限公司)，PCR擴增儀(德國 Biometra T系列)、PCR電泳槽和凝膠成像系統等。

1.3BMSCs及心肌細胞的分離和培養 無菌條件下采集雙側股骨和脛骨骨髓，用含肝素的H-DMEM反復沖洗骨髓腔，收集沖洗液，離心、棄上清，加入含20% FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的H-DMEM培養液4 mL懸浮沉淀細胞，接種于25 cm2塑料培養瓶，放入37 ℃的5%CO2孵箱中進行原代培養。72 h后首次換液，每2～3日換液1次。倒置顯微鏡每日觀察細胞生長情況和形態變化。當細胞約達80%融合時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2或1∶3傳代，通過不斷換液與傳代逐漸純化擴增BMSCs，取第三代細胞用于實驗。

取新生1～3 d的SD乳鼠，開胸取出心臟，將心臟剪成1 mm3大小的碎塊，再將心臟碎片轉移至離心管中，加入0.125%胰蛋白酶5 mL,于37 ℃恒溫水浴下消化5 min，將消化懸液轉移至新離心管，用含20%FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的培養液3 mL終止消化，制成細胞懸液。按上述步驟消化心肌組織4～5次，直至其消化完全。棄掉首次細胞消化懸液，收集余下細胞懸液，離心、棄上清，細胞沉淀用含20%FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的培養液重懸，接種于25 cm2塑料培養瓶，在37 ℃ 5%CO2培養箱中培養，差速貼壁法培養60 min后更換新培養基以純化心肌細胞。此后每2～3日換液1次，并用倒置顯微鏡每日觀察細胞生長情況和形態變化。

1.4體外誘導BMSCs分化為心肌樣細胞的實驗觀察 本實驗將大鼠BMSCs分別用5-氮胞苷誘導和與心肌細胞共培養的方法進行體外誘導，觀察大鼠BMSCs在不同時間段分化為心肌樣細胞的能力及表達心肌細胞特異性標志物。① 5-氮胞苷誘導組：取第三代BMSCs，消化后吹打成細胞懸液，按1×108/L接種于覆蓋有蓋玻片的6孔板，加入10 μmol/L的5-氮胞苷進行誘導，2 d后換回含15%FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的H-DMEM培養液繼續培養，根據培養液顏色變化，每2～3日換液1次。②BMSCs與心肌細胞共培養組：取第三代BMSCs與培養第3日的心肌細胞按細胞數量比1∶2混勻，按1×108/L接種于覆蓋有蓋玻片的6孔板，進行共培養。③對照組：取第三代BMSCs接種于覆蓋有蓋玻片6孔培養板，密度同前，加入含15%FBS、10×104U/L青霉素G、100 mg/L鏈霉素的H-DMEM培養基單獨培養。倒置顯微鏡每日觀察3組細胞生長情況，在培養的第2、4、6、8、10周取6孔板中的4孔分離細胞，用RT-PCR檢測cTnI、CX43和GATA-4基因表達情況(引物見表1)，免疫熒光細胞化學染色檢測心肌細胞的cTnI和Cx43相關蛋白的表達。

表1 RT-PCR擴增cTnI、CX43和GATA-4所用引物

RT-PCR:反轉錄-聚合酶鏈反應;cTnI：肌鈣蛋白I；CX43:縫隙連接蛋白43; GATA-4:心肌特異性轉錄因子4

2 結 果

2.1BMSCs培養情況 BMSCs分離后2～4 h開始貼壁，24 h貼壁完全，細胞形態由圓形、橢圓形逐漸延伸為梭形、多角形，第3～5日細胞開始融合，第7～9日融合可達80%。傳代細胞增殖迅速，3～5日可長滿瓶底。隨著換液與傳代，BMSCs逐漸得到純化。第18～22日可得到第三代細胞，此時細胞多呈梭形，排列方向趨于一致(圖1，見封三)。

2.2心肌細胞的培養及鑒定情況 心肌細胞貼壁前為圓形或橢圓形，培養60 min后開始貼壁，約24 h后貼壁完全，貼壁后細胞多呈梭形、短桿狀，部分為星形、多角形。第2～3日可出現節律性自發搏動細胞，成簇細胞搏動較明顯且搏動頻率不一致，為60～80次/min(圖2，見封三)。培養第3日的心肌細胞經免疫熒光檢測可見有cTnI和Cx43的表達，可見有肌管樣結構(圖3-1～圖3-4，見封三)。

2.3各組細胞形態與生長變化情況 對照組：細胞形態多為梭形，均勻一致，隨著培養時間的延長細胞呈集落或是漩渦狀生長，培養至第10周時部分細胞很難消化且細胞密度較大的細胞群部分崩解，未見有搏動細胞。5-氮胞苷誘導組：5-氮胞苷誘導后部分細胞脫壁死亡，第7日時細胞體積變大，多呈梭形，部分成桿狀，培養至第4周時細胞呈均一的長梭形，集落樣或是漩渦狀生長，到第10周時細胞部分崩解，未見有搏動細胞。共培養組：BMSCs與心肌細胞共培養1～2 h后即貼壁生長，BMSCs呈長梭形，較心肌細胞更為細長，但沒有節律性搏動，1周后BMSCs有趨向搏動心肌細胞的生長趨勢，此后這些梭形細胞呈集落樣生長，2周后可見心肌細胞周邊部分BMSCs搏動，頻率為20～40次/min，4周后搏動頻率為40～60次/min，此時細胞呈肌性排列,隨著培養時間延長,搏動細胞增多，8周后可見部分細胞死亡，10周后搏動細胞較前減少，死亡細胞數增加。

2.4各組RT-PCR及電泳鑒定結果 對照組：cTnI、Cx43和GATA-4mRNA未見有表達；5-氮胞苷誘導組：第2周時cTnI、Cx43和GATA-4mRNA均有表達，GATA-4 mRNA第6周達到高峰，cTnI和Cx43mRNA第8周達高峰，第8、10周未見有統計學差別(圖4-1)。共培養組：cTnI和Cx43mRNA第2～8周表達逐漸增加，第8、10周表達未見有統計學差別；GATA-4第6周達高峰(圖4-2)。

4-1 5-氮胞苷誘導組4-2 共培養組

圖45-氮胞苷誘導組與共培養組目的基因電泳結果Fig1為內參GAPDH；Fig2為cTnI的基因表達；Fig3為GATA-4的基因表達；Fig4為Cx43的基因表達

2.5各組數據統計分析結果 GATA-4 mRNA在共培養組及5-氮胞苷誘導組的表達未見有統計學差異(P>0.05)，而共培養組及5-氮胞苷誘導組中cTnI mRNA、Cx43 mRNA的表達有統計學差異(P<0.05)，且共培養組組中cTnI mRNA、Cx43 mRNA的表達較5-氮胞苷誘導組強，差異具有統計學意義(表2)。

表2 共培養組及5-氮胞苷誘導組GATA-4、cTnI和Cx43mRNA的表達 (n=4)

3 討 論

誘導BMSCs向心肌細胞分化的研究中，5-氮胞苷是目前比較公認的可體外誘導BMSCs分化為心肌樣細胞的藥物[4]。5-氮胞苷是一種DNA甲基轉移酶抑制劑，Fukuda[5]首次證明5-氮胞苷可體外誘導成年鼠骨髓細胞轉化為心肌樣細胞，轉化后的細胞有肌管形成，具有典型的肌小節結構和心肌樣的動作電位等心肌細胞特有的特征,組織學顯示cTnI和肌凝蛋白重鏈陽性。表明BMSCs體外經5-氮胞苷誘導后向心肌樣細胞分化特性，但其機制尚不完全明確。近幾年研究表明，BMSCs向心肌樣細胞分化的過程中，體內心肌環境或體外“心肌樣”環境比單純的化學物質誘導更為重要。袁巖等[6]通過BMSCs與心肌細胞裂解液共培養的方法，體外模擬心肌微環境，結果發現分化后的細胞存在α肌動蛋白、心臟特異性cTnT、Cx43的表達。認為體內心肌環境因素包括細胞間的直接接觸、電機械刺激以及心肌細胞分泌的某些細胞因子等。

基因GATA家族是一類鋅指蛋白轉錄因子，該家族目前共有6個成員:GATA1～6 是一組組織特異性表達的轉錄調節因子，在多種組織的分化和發育中起重要作用。GATA-4參與了心肌的分化和發育，其表達對心肌細胞標志物β肌球蛋白重鏈、心肌肌鈣蛋白、鈉鈣離等轉錄和表達至關重要。GATA-4參與小鼠心臟發育的整個過程的表達，在心肌層中的表達一直持續至出生后[7]。本實驗結果表明，GATA-4 mRNA在5-氮胞苷誘導及與乳鼠心肌細胞共培養組均有表達，說明BMSCs有向心肌細胞分化的潛能，兩組GATA-4 mRNA表達無統計學意義，推測可能與細胞生長環境有關。縫隙連接是一種膜結構，系由一系列細胞間通道構成，介導相鄰細胞間電和化學信號的傳遞。它們由Cx組成，是心肌細胞的特征之一。Cx43是心室肌細胞的主要的Cx。cTnI是心肌細胞的特異性蛋白。肌鈣蛋白由球形亞單位TnT、TnI和TnC構成，TnI球蛋白相互作用，肌鈣蛋白和原肌球蛋白構型變化，則是由Ca2+與TnC結合后引起，通過一系列變化后引起粗細肌絲之間的相對滑動，最終使心肌纖維收縮。本實驗中BMSCs經誘導分化后，RT-PCR結果提示分化后BMSCs心肌特異性基因cTnI表達為陽性，表明誘導后細胞含有心肌特異性結構蛋白，而心肌結構蛋白的出現是心肌細胞收縮的基礎。5-氮胞苷誘導組未見有搏動細胞，可能與細胞生長環境、5-氮胞苷誘導劑量等相關。與乳鼠心肌細胞共培養組有搏動頻率不一致的搏動細胞出現，靠近心肌細胞處搏動較明顯，在培養的第2～6周可見搏動頻率不一的搏動細胞增多，第8～10周搏動細胞數有所減少，且搏動頻率較前降低，同時細胞死亡數較前明顯增多，這可能與細胞生長環境變化等因素有關。

本實驗中cTnI、Cx43及GATA-4僅在誘導組細胞有表達。在一定時間內，隨著培養時間的延長共培養組上述基因的表達較5-氮胞苷誘導組強，但培養10周以后三者的表達未見有明顯差別。5-氮胞苷誘導組未見有搏動細胞，說明該組細胞尚不完全具備成熟心肌細胞的功能，而與乳鼠心肌細胞共培養組不同時段有搏動頻率不一的搏動細胞，且靠近心肌細胞的細胞搏動明顯，這可能與搏動心肌細胞的機械刺激有關。實驗表明，BMSCs于體外在5-氮胞苷誘導及與乳鼠心肌細胞共培養條件下，可被誘導分化為心肌樣細胞。誘導分化后的BMSCs的生長及其細胞狀態的維持需要穩定的生長環境。心肌微環境是促進BMSCs定向分化為心肌樣細胞的因素之一。誘導分化后的BMSCs尚不完全具備成熟心肌細胞的功能。因此，探尋適合BMSCs定向分化的最佳狀態、觀察已分化心肌樣細胞的功能、尋找BMSCs分化為功能性心肌細胞的方法、以及如何保持其長期分化潛能及分化后的狀態仍需進一步研究。

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