肺炎鏈球菌血清型鑒定的分子生物學檢測方法

竇珍珍(綜述)，劉 鋼(審校)

(首都醫科大學附屬北京兒童醫院感染科，北京 100045)

肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)能夠引起肺炎、胸膜炎、中耳炎、腦膜炎、敗血癥等疾病。世界衛生組織(world health organization,WHO)2005年的統計數據表明，全世界每年至少有160萬人死于侵襲性肺炎鏈球菌感染，其中70萬～100萬是<5歲的兒童，且發病人群主要集中在發展中國家[1]。我國的統計數據表明，肺炎鏈球菌是兒童肺炎最常見的病原體，也是細菌性腦膜炎主要的病原體之一，1970～2005年肺炎鏈球菌引起的細菌性腦膜炎在占全部確診病例的10%～30%[2]。

目前，接種肺炎鏈球菌疫苗是最有效的預防肺炎鏈球菌疾病的方法。以分子生物學為基礎的檢測方法由于試劑相對便宜、結果客觀、能直接檢測臨床標本的可能性[3]而日益受到關注。不同的科研團隊設計出了不同的檢測方法，以下對各種實驗方法予以綜述。

1 肺炎鏈球菌疫苗的重要意義

美國2000～2008年推廣使用肺炎鏈球菌7價蛋白多糖結合疫苗(7-valent polysaccharide-protein conjugate vaccine,PCV7)(PCV7覆蓋的血清型為4、6B、9V、14、18C、19F和23F)期間，人群中侵襲性肺炎鏈球菌疾病的發病率在<5歲的兒童中下降了77%，因肺炎入院治療的<2歲兒童下降了39%[4]。歐洲有文獻報道稱，應用PCV7的國家其侵襲性肺炎鏈球菌疾病的發病率下降[5]。基于PCV7在降低侵襲性肺炎鏈球菌疾病發病率的顯著成績，WHO已經推薦PCV7作為國家免疫計劃中的優先項目[1]。肺炎鏈球菌疫苗中除了PCV7外，目前還有13價蛋白多糖結合疫苗、23價莢膜多糖疫苗。這些疫苗均為血清型特異性疫苗，它們對人群的保護作用與疫苗對當地致病性肺炎鏈球菌血清型的覆蓋率有關。雖然目前PCV7在預防肺炎鏈球菌疾病方面已有效果，但肺炎鏈球菌血清型監測仍然十分重要。對于已將PCV7納入國家免疫計劃項目的國家，PCV7對侵襲性肺炎鏈球菌血清型分布的長期影響尚不十分明確。有地區報道稱，應用PCV7后導致了血清型替換現象，即非疫苗血清型定植、致病增多的現象[6-8]。如果肺炎鏈球菌疫苗對侵襲性肺炎鏈球菌血清型覆蓋率降低，對人群的保護效益可能降低。對未納入PCV7作為國家免疫計劃項目的國家(主要是發展中國家和地區)，監測肺炎鏈球菌的重要性主要體現以下三個方面：①目前肺炎鏈球菌感染死亡病例主要是在發展中國家；②這些國家和地區缺乏完善的肺炎鏈球菌血清型監測信息；③目前應用的PCV7覆蓋的血清型種類的設計主要是基于歐洲和北美發達國家侵襲性肺炎鏈球菌血清型的監測，而已有文獻報道稱PCV7的覆蓋率具有顯著的地區差異[1]。

目前檢測肺炎鏈球菌的金標準是莢膜腫脹實驗。莢膜特異性抗體和莢膜結合后在顯微鏡下可觀察到莢膜腫脹顯著，莢膜腫脹實驗就是利用這種原理用血清型已知的抗體檢測菌株的血清型。這種方法的缺點主要是試劑昂貴、結果判讀主觀，且檢測過程需要培養細菌。血清型檢測試劑的昂貴限制了經濟欠發達地區肺炎鏈球菌血清型的檢測，主觀的判讀使部分菌株的結果有誤，且檢測結果還依賴于細菌培養，而使得血清型檢測結果也受培養陽性率的限制。

2 肺炎鏈球菌莢膜基因結構

肺炎鏈球菌莢膜的生成主要受莢膜基因(capsular polysaccharide synthesis locus,CPS)控制，除血清型3和37外，其余血清型的莢膜均由Wzy/Wzx依賴的途徑生成并由cpsA-D調節，這些基因均存在于dexB和aliA之間。cpsA-D是靠近dexB端的前4個相對保守的基因，cpsD和aliA之間的基因是血清型特異性的基因區域[9](圖1)。血清型37的肺炎鏈球菌通過cps外的tts基因指導，由合酶途徑合成莢膜[10]。但在dexB和aliA之間，血清型37有與33F非常相似的結構，只是在cap37B，cap37E，cap37N和cap37O存在沉默子，這些沉默子導致該區域的基因結構不能編碼莢膜(圖2)[10]。血清型3亦依賴合酶途徑合成莢膜[11]。血清型3無cpsA-D基因，但是其orf1和dexB之間的一段序列和血清型19F的cpsA、cpsB相似，orf1、orf2分別與cpsC、cpsD相似，orf2下游和cap3A之間是一段長度為1096 bp 19F缺失的序列(圖3)[12]。cap3A、cap3B、cap3C是血清型3特異性序列[13]。雖然cpsA-D在所有的血清型之間相對保守，但cpsA和cpsB仍存在與血清型相關的多態性[14-17]。莢膜基因是以分子生物學為基礎的血清型檢測方法的基礎。目前，93種血清型的莢膜基因序列都已測出[9](http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_pneumoniae/CPS/)，這將助于以分子生物學方法研究肺炎鏈球菌的血清型。

圖1 血清型cps結構圖

圖2 血清型33F和血清型37 cps結構圖

圖3 血清型3和血清型19Fcps結構圖

3 已有的分子生物學檢測方法

已有的以分子生物學為基礎的血清型檢測方法可分為兩類，一類是以檢測cps基因血清型特異性區域為基礎的方法，如多重聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、多重PCR反向線性雜交、基因芯片；另一類是以檢測與血清型相關的cps基因多態性為基礎的方法，如限制性片段多態性、以測序為基礎的血清型檢測方法。

3.1多重PCR和連續多重PCR 多重PCR檢測血清型是利用多種血清型特異性引物的混合物與待測標本提取的DNA進行PCR擴增，通過PCR擴增產物的大小判斷待測標本的血清型。2005年，O′Halloran等[18]設計了用1個反應體系檢測PCV7覆蓋的7種肺炎鏈球菌血清型，結果顯示這種方法能夠準確預測所覆蓋的7種血清型的所有菌株。但是，PCV7推廣應用后出現的血清型替換現象可使PCV7覆蓋率下降的同時，也削弱該方法檢測肺炎鏈球菌血清型的能力[6-8]。

增加血清型檢測范圍可削弱血清型替換對血清型檢測方法的影響，但是多重PCR體系需要考慮引物的兼容性以及擴增產物的大小[19-20]，因此在一個PCR反應體系中能夠檢測的血清型的種類是有限的。連續多重PCR通過多次多重PCR(每次多重PCR引物組成不同)增加了血清型檢測范圍。2006年，Pai等[19]設計的連續多重PCR能夠檢測28種常見致病性肺炎鏈球菌。此方法共包含有7步PCR反應，每一步PCR反應能夠檢測4種血清型，每一步PCR均擴增cpsA基因作為內對照，常見的致病血清型用第一步PCR和第二步PCR檢測，以便使用最少的PCR反應步驟檢測血清型的分布。檢測過程中，血清型特異性PCR產物對應的血清型為標本的血清型，PCR反應后若cpsA陽性但血清型特異性PCR陰性則進入下一步PCR，7步PCR完成后若仍只有cpsA陽性，則該標本的血清型未包括在連續多重PCR檢測范圍內，cpsA陰性的標本為未分型菌株[19]。

連續多重PCR的檢測效率高，檢測結果準確，且檢測成本遠低于莢膜腫脹實驗。用連續多重PCR的方法檢測了隨機從2002～2003年收集的菌株中挑選的421株菌株，前3步多重PCR能檢測62.5%菌株的血清型，7步PCR完成后401(95.2%)株菌株能確定血清型/群，20株菌株不能確定血清型/群的菌株為未分型菌株或檢測范圍外的血清型[19]。應用連續多重PCR預測的血清型結果與莢膜腫脹實驗預測結果均相符[19]。Pai等[19]統計，莢膜腫脹實驗檢測肺炎鏈球血清型的平均成本是28美元，而應用連續多重PCR，3步PCR完成血清型檢測的成本是2.28美元，7步PCR完成血清型檢測的成本是5.32美元。此外，還可根據當地肺炎鏈球菌血清型流行情況調整血清型的檢測步驟、增加血清型的檢測范圍。在血清型分布不同的地區連續多重PCR的應用有很強的靈活性，已有巴西[21]、西班牙[22]、比利時[23]、孟加拉國[24]、芬蘭[25]、韓國[26]、中國[27]、撒哈拉以南的非洲地區[28]的研究人員根據當地肺炎鏈球菌血清型流行病學資料在原始連續多重PCR的基礎上設計并驗證了新的血清型檢測方案。以連續多重PCR為基礎的血清型檢測方法可直接檢測生物標本中的肺炎鏈球菌血清型，孟加拉國的研究人員已經利用這種方法檢測了培養陰性的腦脊液中肺炎鏈球菌的血清型[29]。連續多重PCR還可以檢測存在多種血清型標本的血清型。檢測中耳炎患者鼻咽部分泌物中肺炎鏈球菌血清型的研究發現，鼻咽部分泌物分離培養的菌株用莢膜腫脹實驗檢測結果為19F，而用連續多重PCR直接從鼻咽部分泌物提取的DNA，可同時檢測出血清型19F和23F[30]。

多重PCR產生錯誤結果的主要原因是讀膠時產生錯誤[20]，PCR擴增產物大小接近，同一個PCR反應體系檢測的血清型種類過多則增加發生這種錯誤發生的概率，因此單個PCR反應體系檢測的血清型不宜過多。

3.2多重PCR反向線性雜交和基因芯片技術 多重PCR反向線性雜交和基因芯片技術檢測肺炎鏈球菌血清型的技術基礎為特異性探針與目標DNA雜交，它們共同的特點是在擴大血清型檢測范圍的同時最大限度地減少PCR反應次數。

2006年，Kong等[31]利用多重PCR反向線性雜交技術，設計了能夠檢測23組共40種血清型的血清型檢測方法。2007年，Zhou等[32]又設計了20組共50種少見血清型的檢測方法(不包括6C、6D和11E)。多重PCR反向線性雜交技術檢測肺炎鏈球菌的血清型，首先對標本提取的DNA進行多重PCR擴增(血清型特異性PCR)，然后利用尼龍膜上結合的血清型特異性的單核苷酸探針和生物素標記的多重PCR反應產物雜交，再利用過氧化物酶標記的抗生蛋白鏈菌素和生物素結合并利用化學發光物質檢測過氧化物酶，最后利用探針位置及種類與尼龍膜對應的膠片檢測熒光。膠片上產生熒光的位置對應的探針種類就是被檢測標本的血清型[31]。Kong等[31]用設計的多重PCR反向線性雜交技術檢測266株菌株，Zhou等[32]用設計的多重PCR反向線性雜交技術檢測了152株菌株，除血清型未覆蓋菌株和未分型菌株雜交結果陰性外，其余菌株的血清型預測結果和莢膜腫脹實驗一致或包含了莢膜腫脹實驗結果(血清型組包含2種或以上的血清型)。

基因芯片是不同血清型的DNA探針按照一定順序排列的微小基片。

2007年，Wang等[33]設計了通過檢測肺炎鏈球菌wzy基因和cap基因(血清型3)來檢測24組共43種血清型的基因芯片(多重PCR發生交叉反應的血清型歸為同一組)。基因芯片上，每組血清型有兩種探針，同時有兩種16SrDNA探針作為陽性對照，40個T組成的探針作為陰性對照。用這種基因芯片檢測血清型過程如下：DNA樣本經一次多重PCR擴增后，以擴增產物為模板，將雙向引物換成單向引物并加入Cy3-dUTP后，在相同的實驗條件下再次擴增，再次擴增的產物與芯片雜交，基因芯片平掃儀檢測雜交后芯片的信號，所收集的數據通過相關軟件分析后可確定血清型種類。

Wang等[33]用設計的基因芯片檢測了169株標本(147株屬于檢測范圍的43種血清型，11株為檢測范圍外的血清型，11株為其他病原體)，結果與莢膜腫脹實驗的結果相符。此外，這種基因芯片檢測血清型的靈敏度較高。研究發現，DNA提取濃度為1010 cfu/L時，用基因芯片能確定血清型種類，而用多重PCR則無法檢測血清型[32]。因此，在檢測DNA含量較少的臨床標本時，基因芯片檢測血清型有顯著的優勢。

2011年Tomita等[34]設計了一種新的檢測血清型的基因芯片。芯片通過與肺炎鏈球菌GT基因(糖基轉移酶基因)雜交而能檢測23組共37種血清型(多重PCR發生交叉反應的血清型歸為同一組)。基因芯片上，每組血清型檢測1～6個GT基因，每一個GT基因有3種不同的探針。此外，基因芯片上包含了16SrDNA以及與肺炎鏈球菌的7個看家基因(aroE/ddl/gdhA/glcK/spi/tktA/xpt)互補的探針作為陽性對照，與肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺軍團菌、肺炎衣原體、肺炎支原體、綠膿桿菌、化膿性鏈球菌的看家基因互補的探針作為陰性對照。血清型檢測過程中，基因芯片直接與提取的菌株基因組DNA雜交，分析數據判斷血清型。該方法僅檢測了檢測范圍內的36種血清型的36株肺炎鏈球菌，其中1株結果和莢膜腫脹實驗結果不符。目前，基因芯片血清型檢測的準確性還需要更進一步的提高。

與連續多重PCR相比，多重PCR反向線性雜交及基因芯片技術最大的特點是檢測的血清型種類多，且不需要多次進行PCR反應，但是這種方法涉及的引物及探針種類多(多重PCR反向線性雜交檢測90種血清型需200種引物或探針)，多種血清型之間可發生交叉反應(多重PCR反應線性雜交檢測的90種血清型中有58種血清型能發生交叉反應)，能發生交叉反應的血清型需與其他血清型檢測方法結合方能進一步區分。目前發現的肺炎鏈球菌血清型種類雖已達93種，但常見的血清型種類有限，連續多重PCR前三步PCR反應就能夠檢測60%～90%的肺炎鏈球菌菌株的血清型[19,21-23,25-26,28-30]。因此在檢測常見血清型時，上述兩種血清型檢測方法在時間消耗、操作以及血清型檢測成本上并無明顯優勢。利用基因芯片檢測血清型的缺點是該方法的設備有特殊要求(需要基因芯片掃描儀)，對于經濟欠發達地區的應用可能受到限制。

3.3限制性片段長度多態性 限制性片段長度多態性是一種可用于檢測基因多態性的分子生物學分析方法，同源DNA，因為存在基因多態性，應用限制性內切酶后可產生不同的DNA片段圖譜。Lawrence等[16]發現，肺炎鏈球菌cpsA和cpsB基因限制性片段長度多態性與血清型相關，根據這一特點，設計了通過檢測限制性片段長度的多態性而預測肺炎鏈球菌11種血清型的檢測方法。每種血清型的cpsA-cpsB PCR擴增產物分別用AluI、HinfI和RsaI3種酶進行酶切，同種酶得到的條帶分型用譜圖分析軟件(GelCompar,version 4.1)進行對比分析并命名，每一種血清型可獲得3種酶切后的條帶分型。通過研究11種血清型條帶分型，建立條帶分型和血清型關系數據庫。血清型未知的菌株的條帶分型和數據庫中條帶分型的相似度≥90%時，認為是相同的條帶分型，可以通過對比血清型已知的條帶分型數據庫預測未知肺炎鏈球菌的血清型。

Lawrence等[16]用建立的數據庫檢測了93株菌株，87株檢測結果與莢膜腫脹實驗相符，1株血清型為1的菌株被預測為血清型1或19F，4株血清型為6A的菌株被預測為6B，2株血清型分別為6B和9V的菌株出現在數據庫中，未有條帶分型被錯誤判斷為非疫苗菌株。提示某些菌株只能給出血清型可能范圍，這種方法不能正確區分血清型6A和6B，新的條帶分型可導致血清型判斷錯誤。

Batt等[35]擴增dexB和ailA之間的所有序列(大小為14～23 kpb)，并單獨應用Hinfl酶切獲得條帶分型。通過46種血清型已知的菌株建立了46種血清型條帶分型的數據庫。用該數據庫檢測了73株菌株，所有菌株的結果均和莢膜腫脹實驗相符。與Lawrence等[16]設計的方法相比，Batt等[35]設計的方法在構建條帶、分型數據庫以及條帶對比時更簡單。Lawrence設計的方法，每種血清型對應3種條帶分型。Batt等設計的方法是每種血清型對應1種條帶分型。但是，Batt設計的方法PCR擴增產物高達14～23 kpb，這在擴增產物方面增加了難度。

限制性長度片段多態性的缺點是每次進行檢測都必須有標準株建立比對的數據庫，而且，血清型檢測范圍內的菌株如出現新的條帶分型，會導致結果判讀錯誤。

3.4測序為基礎的血清型檢測方法 肺炎鏈球菌cpsA 3′端到cpsB 5′端之間的序列多態性與血清型相關[15-16]。Kong等[17,36]通過對90種血清型的這段基因進行測序，建立了部分cpsA-cpsB血清型預測系統。血清型未知的菌株在cpsA 3′端和cpsB 5′端之間的序列和部分cpsA-cpsB血清型預測系統比對可預測血清型未知菌株的血清型。

2011年，Leung等[14]設計了一種新的以測序為基礎的血清型檢測方法。他們擴增的區域位于cpsA下游1351位點到cpsC下游224位點之間，擴增產物達1064 kpb，但是兩側的測序結果可能不確切，因此采用中間的732 kpb與基因庫比對，比對后分數最高的對應的血清型為血清型檢測結果。這種新的以測序為基礎的血清型檢測方法通過比對PPV23覆蓋的血清型的基因序列設計引物，除 PPV23覆蓋的血清型外，還可以擴增另外61種血清型。Leung等用該方法檢測了138株菌株，僅1株菌株血清型預測錯誤。

以這兩種測序為基礎的血清型檢測方法的引物結合區都是相對保守區域，能與引物結合的血清型種類多，這使血清型檢測過程中涉及的引物種類少(Kong等[17,36]設計的檢測方法需要三對引物；Leung等[14]設計的檢測方法需要一對引物)。這一特點簡化了血清型檢測過程。但是，由于引物不是血清型特異性引物，混雜其他血清型的DNA對血清型檢測的影響還需要進行進一步試驗來判斷。

4 小 結

與莢膜腫脹實驗相比，以分子生物學為基礎的血清型檢測方法雖然有試劑相對便宜、結果客觀以及有直接檢測培養陰性臨床標本的可能性的優點，但也有不足。首先，目前設計的以分子生物學為基礎的血清型檢測方法均不能完全區分所有的血清型。一些血清型相近的菌株莢膜基因差異很小而在PCR過程中會發生交叉反應，如血清型6A和6B在wciP基因上存在單個核苷酸多態性[37]。一些血清型雖并不相似，但可能因為PCR擴增的目的基因相似而發生交叉反應，如35F和47F，33F、33A和37[19,31]。其次，肺炎鏈球菌的血清型屬于莢膜抗原特異性，以分子生物學為基礎的血清型檢測方法只是一種間接的血清型檢測方法，它的檢測結果可以與莢膜腫脹實驗的結果不一致。有文獻報道稱，用莢膜腫脹實驗檢測血清型為19F的2株基因背景不一樣的菌株血清型特異性PCR擴增產物為19A，將該菌株wzy基因測序比對后發現，這2株菌株wzy基因與血清型19Fwzy基因的相似度為92%，而與血清型19Awzy基因的相似程度為80%[25]。因此，以分子生物學為基礎的血清型檢測方法不能完全替代莢膜腫脹實驗。盡管如此，其還是可以與莢膜腫脹實驗聯合應用以降低血清型檢測成本。目前，連續多重PCR經驗證是使用最多的血清型檢測方法，僅極少量菌株的檢測結果出現錯誤，極少量的菌株因引物區的基因多態性而PCR擴增失敗[23]。芬蘭已將連續多重PCR作為血清型檢測的常規方法，用連續多重PCR不能檢測出血清型的菌株或因交叉反應血清型不能確定的菌株再用莢膜腫脹實驗確定血清型。聯合應用連續多重PCR和莢膜腫脹實驗，降低了血清型檢測成本[25]。

[1] Pneumococcal conjugate vaccine for childhood immunization--WHO position paper[J].Wkly Epidemiol Rec,2007,82(12):93-104.

[2] Yao KH,Wang LB,Zhao GM,etal.Pneumococcal serotype distribution and antimicrobial resistance in Chinese children hospitalized for pneumonia[J].Vaccine,2011,29(12):2296-2301.

[3] Azzari C,Moriondo M,Indolfi G,etal.Molecular detection methods and serotyping performed directly on clinical samples improve diagnostic sensitivity and reveal increased incidence of invasive disease by Streptococcus pneumoniae in Italian children[J].J Med Microbiol,2008,57(Pt 10):1205-1212.

[4] Centers for Disease Control and Prevention (CDC).Progress in introduction of pneumococcal conjugate vaccine—worldwide,2000-2008[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep,2008,57(42):1148-1151.

[5] Isaacman DJ,Mcintosh ED,Reinert RR.Burden of invasive pneumococcal disease and serotype distribution among Streptococcus pneumoniae isolates in young children in Europe:impact of the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine and considerations for future conjugate vaccines[J].Int J Infect Dis,2010,14(3):e197-e209.

[6] Weinberger DM,Malley R,Lipsitch M.Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination[J].Lancet,2011,378(9807):1962-1973.

[7] Klugman KP.The significance of serotype replacement for pneumococcal disease and antibiotic resistance[J].Adv Exp Med Biol,2009,634:121-128.

[8] Hanage WP.Serotype replacement in invasive pneumococcal disease:where do we go from here?[J].J Infect Dis,2007,196(9):1282-1284.

[9] Bentley SD,Aanensen DM,Mavroidi A,etal.Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes[J].PLoS Genet,2006,2(3):e31.

[10] Llull D,Muoz R,López R,etal.A single gene (tts) located outside the cap locus directs the formation of Streptococcus pneumoniae type 37 capsular polysaccharide.Type 37 pneumococci are natural,genetically binary strains[J].J Exp Med,1999,190(2):241-251.

[11] Caimano MJ,Hardy GG,Yother J.Capsule genetics in Streptococcus pneumoniae and a possible role for transposition in the generation of the type 3 locus[J].Microb Drug Resist,1998,4(1):11-23.

[12] Guidolin A,Morona JK,Morona R,etal.Nucleotide sequence analysis of genes essential for capsular polysaccharide biosynthesis in Streptococcus pneumoniae type 19F[J].Infect Immun,1994,62(12):5384-5396.

[13] Arrecubieta C,García E,López R.Sequence and transcriptional analysis of a DNA region involved in the production of capsular polysaccharide in Streptococcus pneumoniae type 3[J].Gene,1995,167(1/2):1-7.

[14] Leung MH,Bryson K,Freystatter K,etal.Sequetyping:Serotyping Streptococcus pneumoniae by a Single PCR Sequencing Strategy[J].J Clin Microbiol,2012,50(7):2419-2427.

[15] Jiang SM,Wang L,Reeves PR.Molecular characterization of Streptococcus pneumoniae type 4,6B,8,and 18C capsular polysaccharide gene clusters[J].Infect Immun,2001,69(3):1244-1255.

[16] Lawrence ER,Arias CA,Duke B,etal.Evaluation of serotype prediction by cpsA-cpsB gene polymorphism in Streptococcus pneumoniae[J].J Clin Microbiol,2000,38(4):1319-1323.

[17] Kong F,Wang W,Tao J,etal.A molecular-capsular-type prediction system for 90 Streptococcus pneumoniae serotypes using partial cpsA-cpsB sequencing and wzy- or wzx-specific PCR[J].J Med Microbiol,2005,54(Pt 4):351-356.

[18] O′Halloran DM,Cafferkey MT.Multiplex PCR for identification of seven Streptococcus pneumoniae serotypes targeted by a 7-valent conjugate vaccine[J].J Clin Microbiol,2005,43(7):3487-3490.

[19] Pai R,Gertz RE,Beall B.Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates[J].J Clin Microbiol,2006,44(1):124-131.

[20] Miernyk K,Debyle C,Harker-Jones M,etal.Serotyping of Streptococcus pneumoniae isolates from nasopharyngeal samples:use of an algorithm combining microbiologic,serologic,and sequential multiplex PCR techniques[J].J Clin Microbiol,2011,49(9):3209-3214.

[21] Dias CA,Teixeira LM,Carvalho Mda G,etal.Sequential multiplex PCR for determining capsular serotypes of pneumococci recovered from Brazilian children[J].J Clin Microbiol,2007,56(Pt 9):1185-1188.

[22] Iraurgui P,Torres MJ,Gandia A,etal.Modified sequential multiplex PCR for determining capsular serotypes of invasive pneumococci recovered from Seville[J].Clin Microbiol Infect,2010,16(9):1504-1507.

[23] Jourdain S,Dreze PA,Drèze PA,etal.Sequential multiplex PCR assay for determining capsular serotypes of colonizing S.pneumoniae[J].BMC Infect Dis,2011,11(11):100.

[24] Saha SK,Al Emran HM,Hossain B,etal.Streptococcus pneumoniae serotype-2 childhood meningitis in Bangladesh:a newly recognized pneumococcal infection threat[J].PLoS One,2012,7(3):e32134.

[25] Siira L,Kaijalainen T,Lambertsen L,etal.From quellung to multiplex PCR,and back when needed,in pneumococcal serotyping[J].J Med Microbiol,2012,50(8):2727-2731.

[26] Yun KW,Cho EY,Hong KB,etal.Streptococcus pneumoniae type determination by multiplex polymerase chain reaction[J].J Korean Med Sci,2011,26(8):971-978.

[27] Zhang YJ,Chen YS,Wang ZW,etal.Serological and molecular capsular typing,antibiotic susceptibility and multilocus sequence typing of Streptococcus pneumoniae isolates from invasive and non-invasive infections[J].Chin Med J (Engl),2013,126(12):2296-2303.

[28] Morais L,Carvalho Mda G,Roca A,etal.Sequential multiplex PCR for identifying pneumococcal capsular serotypes from South-Saharan African clinical isolates[J].J Med Microbiol,2007,56(Pt 9):1181-1184.

[29] Saha SK,Darmstadt GL,Baqui AH,etal.Identification of serotype in culture negative pneumococcal meningitis using sequential multiplex PCR:implication for surveillance and vaccine design[J].PLoS One,2008,3(10):e3576.

[30] Billal DS,Hotomi M,Suzumoto M,etal.Determination of pneumococcal serotypes/genotypes in nasopharyngeal secretions of otitis media children by multiplex PCR[J].Eur J Pediatr,2008,167(4):401-407.

[31] Kong F,Brown M,Sabananthan A,etal.Multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay to identify 23 Streptococcus pneumoniae polysaccharide vaccine serotypes[J].J Clin Microbiol,2006,44(5):1887-1891.

[32] Zhou F,Kong F,Tong Z,etal.Identification of less-common Streptococcus pneumoniae serotypes by a multiplex PCR-based reverse line blot hybridization assay[J].J Clin Microbiol,2007,45(10):3411-3415.

[33] Wang Q,Wang M,Kong F,etal.Development of a DNA microarray to identify the Streptococcus pneumoniae serotypes contained in the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine and closely related serotypes[J].J Microbiol Methods,2007,68(1):128-136.

[34] Tomita Y,Okamoto A,Yamada K,etal.A new microarray system to detect Streptococcus pneumoniae serotypes[J].J Biomed Biotechnol,2011,2011:352736.

[35] Batt SL,Charalambous BM,Mchugh TD,etal.Novel PCR-restriction fragment length polymorphism method for determining serotypes or serogroups of Streptococcus pneumoniae isolates[J].J Clin Microbiol,2005,43(6):2656-2661.

[36] Kong F,Gilbert GL.Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes[J].J Med Microbiol,2003,52(Pt 12):1047-1058.

[37] Mavroidi A,Godoy D,Aanensen DM,etal.Evolutionary genetics of the capsular locus of serogroup 6 pneumococci[J].J Bacteriol,2004,186(24):8181-8192.