miRNA在急性心肌梗死診斷中的研究進(jìn)展

裴穎皓(綜述)，宮劍濱(審校)

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院/南京軍區(qū)南京總醫(yī)院心臟內(nèi)科，南京 210002)

微RNA(micorRNA，miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一組內(nèi)源性高度保守的非編碼單鏈RNA，其在細(xì)胞核內(nèi)生成，由20～22個(gè)核糖核苷酸組成，調(diào)控上游基因表達(dá)和下游蛋白翻譯過(guò)程。1993年，Lee等[1]在線蟲(chóng)的胚胎中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)miR-lin-4。由于miRNA能調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)，能夠識(shí)別特定的目標(biāo)信使RNA(mRNA)，使其在表達(dá)水平上發(fā)生變化，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)基因的上調(diào)或下調(diào)。目前miRNA已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)，近年的研究表明miRNA可能與急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的發(fā)生密切相關(guān)。

1 miRNA概述

1.1miRNA的生成與作用機(jī)制 編碼miRNA的基因通過(guò)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)度約數(shù)千個(gè)堿基的初級(jí)miRNA(pri-miRNA)。pri-miRNA具有帽子結(jié)構(gòu)和多聚核苷酸尾巴，在雙鏈RNA特異核酸酶Drosha及其輔助因子的作用下被剪切成60～100個(gè)核苷酸組成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)前體(pre-miRNA)。pre-miRNA再被核穿膜蛋白蛋白5識(shí)別并從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在雙鏈RNA特異性核糖核酸酶Dicer作用下進(jìn)行第二次裂解，生成一種長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的雙鏈miRNA復(fù)合體，隨后在RNA解螺旋酶作用下，一條為成熟的miRNA并結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物上，RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物依據(jù)其miRNA與靶基因序列的互補(bǔ)性高低發(fā)揮作用，若是完全或幾乎完全配對(duì)，則導(dǎo)致mRNA降解；若不完全配對(duì)，則影響mRNA的成熟、轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定、調(diào)控和翻譯等，從而反向調(diào)控靶基因的表達(dá)[2]。而另一條鏈通常稱為未成熟miRNA(minor miRNA)，以往被認(rèn)為解螺旋后將會(huì)被酶解，但是最新的研究發(fā)現(xiàn)一部分minor miRNA并沒(méi)有被酶解，而是調(diào)控體內(nèi)miRNA的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響著下游的轉(zhuǎn)錄和翻譯[3]。

miRNA在循環(huán)中較穩(wěn)定，可能與外分泌體或微粒的包裹有關(guān)，核糖核酸酶、多次凍融循環(huán)和強(qiáng)酸強(qiáng)堿等均不容易破壞它們。但若把異種miRNA注入人體內(nèi)，則會(huì)被迅速降解[4]。

1.2miRNA的命名 一個(gè)系統(tǒng)的命名包含三部分內(nèi)容，即物種、miRNA類別、序號(hào)，三者間用短線連接(表1)[5]。

表1 miRNA的命名

1.3miRNA的調(diào)控 生理狀態(tài)下血清中miRNA水平如何調(diào)控，病理情況下miRNA變化的調(diào)控機(jī)制至今仍有爭(zhēng)論。有學(xué)者認(rèn)為以下幾點(diǎn)值得關(guān)注[6]：①細(xì)胞膜受損后miRNA由細(xì)胞內(nèi)游離出細(xì)胞外；②應(yīng)激條件下肝細(xì)胞釋放；③細(xì)胞內(nèi)miRNA的合成與降解平衡；④循環(huán)中miRNA的降解；⑤細(xì)胞吸收胞外的miRNA。

上述5點(diǎn)相互促進(jìn)、相互制約共同決定血清miRNA水平變化。D′Alessandra等[6]發(fā)現(xiàn)一只大鼠結(jié)扎冠狀動(dòng)脈后血清miR-1、miR-133a/b和miR-499-5p表達(dá)升高，而在梗死區(qū)或缺血區(qū)上述miRNA表達(dá)下降，提示AMI后miRNA的升高主要是細(xì)胞受損后釋放出來(lái)的。但矛盾的是至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他心肌特異miRNA，如miR-24、miR-26a、miR-126和miR-30c在AMI后水平升高[7]。因此，血清中miRNA水平的具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究。

2 miRNA與AMI

生理情況下，血清中存在豐富的miRNA，當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)，胞質(zhì)中的miRNA游離到細(xì)胞外，是潛在的診斷標(biāo)志物。早年的一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明,miRNA在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后修飾水平調(diào)節(jié)著心肌生長(zhǎng)發(fā)育、纖維化和重構(gòu)等。通過(guò)對(duì)心肌梗死動(dòng)物血清的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)一些miRNA在AMI后動(dòng)態(tài)變化。其中影響著心肌生長(zhǎng)、發(fā)育和纖維化的miRNA在心肌梗死后的早期會(huì)大量表達(dá)。因此，心肌梗死后患者血清中miRNA的動(dòng)態(tài)變化意義重大[8]。

2.1miRNA與AMI的診斷 目前對(duì)于AMI診斷與miRNA研究很多，主要包括miR-1、miR-133a/b、miR-499-5p、miR-208a/b等，但各項(xiàng)研究結(jié)果矛盾較多。

Zile等[8]認(rèn)為，AMI后血清miRNA的水平變化與AMI后的心肌重構(gòu)相關(guān),他們對(duì)比了AMI患者心肌梗死后第2日和3個(gè)月的左心室舒張末期容積和血清miRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMI后左心室舒張末期容積逐漸增加；miR-21在AMI后第2日表達(dá)下降，但在第5日表達(dá)上升并超過(guò)基線，到后期逐漸恢復(fù)基線水平；miR-29a在心肌梗死后第5日升高，后期逐漸回到基線水平；miR-208在心肌梗死后第5日增加，直到3個(gè)月它的水平依然高于基線。

Ai等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-1是AMI潛在的診斷標(biāo)志物，他們通過(guò)檢測(cè)159例冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的血清miR-1水平，發(fā)現(xiàn)AMI患者血清miR-1水平顯著升高，出院后其水平逐漸恢復(fù)到基線，并且miR-1的表達(dá)量與年齡、性別、血壓、糖尿病以及心肌酶譜等無(wú)關(guān)；ROC曲線分析計(jì)算曲線下面積為0.774。

同樣，Chen等[10]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-1是一個(gè)高敏的AMI標(biāo)志物，細(xì)胞模型中觀察到培養(yǎng)液中的miR-1升高且持續(xù)24 h左右；大鼠AMI模型中檢測(cè)到血清miR-1在AMI后6 h內(nèi)迅速升至峰值(約為基線的200倍)，3 d后回到基線水平；大鼠缺血預(yù)適應(yīng)模型中發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)適應(yīng)明顯減少了血清miR-1水平和再灌注心肌損傷。臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[9]，AMI患者血清miR-1顯著升高，且與肌酸激酶MB亞型呈正相關(guān)。

D′Alessandra等[6]發(fā)現(xiàn)AMI后血清miR-1、miR-133a/b和miR-499-5p的水平上調(diào)，miR-122、miR-375水平下調(diào)，分析AMI患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)或溶栓治療前后血清miRNA和肌鈣蛋白I(cardiac Troponin I，cTnI)的動(dòng)態(tài)變化后發(fā)現(xiàn)miR-1、miR-133/b和cTnI的時(shí)間窗相似。大鼠AMI模型的結(jié)果與上述臨床結(jié)果基本一致。但是,在Ai等[9]的研究中，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)心肌梗死后miR-133水平的變化，因此miR-133對(duì)于診斷心肌梗死的意義仍需進(jìn)一步證實(shí)。

Ji等[11]首先在359個(gè)候選miRNA中篩出心肌特異性miR-208和miR-490，后者少量表達(dá)于大小腸、肺、腎上腺和胃組織，所以選用miR-208作為AMI標(biāo)志物在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠AMI模型中與cTnI進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異丙腎上腺素注射3 h后，cTnI和miR-208都顯著上升，miR-208在12 h后開(kāi)始回落，cTnI在24 h后依然高于基線水平，在時(shí)間窗上兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是,上述實(shí)驗(yàn)存在一些問(wèn)題，如β受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素引起的心肌損傷與冠狀動(dòng)脈阻塞引起的AMI不能等同，所以上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不能完全令人信服。

Wang等[12]利用大鼠AMI模型，綜合比較了心肌特異性miR-1、miR-133a、miR-499、miR-208a在AMI后的血清表達(dá)差異，并最終發(fā)現(xiàn)miR-208a靈敏度高且特異性強(qiáng)。與Ji等[11]研究不同的是，Wang等[12]通過(guò)結(jié)扎大鼠左前降支冠狀動(dòng)脈構(gòu)建AMI模型并分析不同時(shí)間點(diǎn)(結(jié)扎后0、1、3、6、12、24 h)miRNA的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果miR-208a在結(jié)扎后30 min開(kāi)始升高，3 h達(dá)到峰值，6～12 h開(kāi)始回落，24 h后檢測(cè)不到。臨床試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-1、miR-133a和miR-499在非冠心病組中極少量存在，但miR-208a未能檢測(cè)到；四種miRNA在AMI組顯著升高，其中AMI癥狀出現(xiàn)起始時(shí)有90.9%的患者miR-208a升高，而4 h內(nèi)所有患者的miR-208a均升高；ROC曲線分析曲線下面積分別是0.965,0.822,0.847,0.867和0.987；最佳階段值分析miR-208a的特異度(100%)顯著優(yōu)于miR-1(33.3%)、miR-133a(15.2%)、miR-499(36.4%)[9]。但D′Alessandra等[6]持否定意見(jiàn)，因?yàn)樯鲜鲈囼?yàn)中實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果顯示CT峰值平均只有34.5，說(shuō)明起始循環(huán)拷貝數(shù)較低，試驗(yàn)誤差較大。AMI患者樣本量只有33例，偏差較大。同時(shí)，他們?cè)噲D在9例AMI患者中驗(yàn)證，只有3例血清中有少量的miR-208a升高，其他均檢測(cè)不到。

上述研究結(jié)果存在不少矛盾，其原因有可能與藥物的影響有關(guān)。Zhu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，普萘洛爾可以明顯減少大鼠AMI面積，比較普萘洛爾干預(yù)前后miRNA表達(dá)譜后發(fā)現(xiàn)兩組的相似度只有0.39，而這種差異是普洛萘爾導(dǎo)致的。

上述研究均證明血清miRNA在診斷AMI方面有著特有的優(yōu)勢(shì)，但是具體到各個(gè)miRNA時(shí)，卻存在一定的爭(zhēng)議。總的來(lái)說(shuō)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)研究都存在樣本量少、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不完善、比較不全面、藥物干擾等不足。上述研究存在的共同缺陷是期望單一miRNA進(jìn)行疾病診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者提出利用多種血清miRNA組成的指紋譜聯(lián)合診斷疾病，大大提高了診斷預(yù)測(cè)的敏感性和特異性，在肺癌[14]、卵巢癌[15]、結(jié)直腸癌[16]、糖尿病[17]等疾病的研究中均有報(bào)道。

2.2肌鈣蛋白與miRNA 肌鈣蛋白是臨床上常用的心肌損傷標(biāo)志物，通常在心肌損傷后4～8 h內(nèi)開(kāi)始升高[18]。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，miRNA在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后1 h即可升高，敏感性顯著高于肌鈣蛋白[19]。在心肌細(xì)胞內(nèi)，肌鈣蛋白主要是結(jié)合在肌原纖維上，只有2.8%～4.1%的cTnI存在于細(xì)胞質(zhì)中，而miRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成的復(fù)合物絕大部分存在于細(xì)胞質(zhì)中[18]。這種差異可能導(dǎo)致細(xì)胞損傷時(shí)肌鈣蛋白和miRNA釋放速度不同。肌鈣蛋白主要由腎臟排泄，終末期腎病患者偶見(jiàn)升高，因此腎功能在一定程度上影響肌鈣蛋白檢測(cè)的靈敏度。在雙腎切除大鼠模型的血清中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)miRNA升高，說(shuō)明miRNA的代謝不受腎功能影響。檢測(cè)效率方面，miRNA主要通過(guò)PCR儀分析，比肌鈣蛋白的檢測(cè)更加快捷方便。因此，miRNA比肌鈣蛋白更具有臨床實(shí)用價(jià)值。

2.3miRNA對(duì)AMI后并發(fā)癥的影響 當(dāng)患者發(fā)生AMI后，循環(huán)中的心臟特異性miRNA表達(dá)量會(huì)發(fā)生明顯變化，這次變化的miRNA同時(shí)也參與到AMI后并發(fā)癥的發(fā)生機(jī)制中，如miR-499-5p的水平上調(diào)與細(xì)胞衰老密切相關(guān)，可能在細(xì)胞分化終末期發(fā)揮重要作用。也有實(shí)驗(yàn)證明，miR-499可以促進(jìn)心肌祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化[20]。

雖然miR-1和miR-133由不同的基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄，但是兩者僅有一個(gè)堿基差異，因此它們的生物學(xué)作用十分相似。它們可以通過(guò)抑制部分生長(zhǎng)基因，進(jìn)而控制心肌肥厚的發(fā)展[21]。它們都對(duì)起搏電流If有影響，所以參與了心律失常的調(diào)控[22]。在誘導(dǎo)細(xì)胞方面，miR-1主要起促凋亡作用，而miR-133則相反。

Fleissner等[23]發(fā)現(xiàn)miR-24可以通過(guò)靶向作用轉(zhuǎn)錄因子GATA2和依賴p21激活PAK4(p21活化激酶4)激酶，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。在斑馬魚(yú)胚胎中發(fā)現(xiàn)，提高miR-24表達(dá)后可能因?yàn)榧?xì)胞凋亡增加而損害血管生成發(fā)育。因此，miR-24可能影響AMI面積以及AMI后心肌重構(gòu)和心功能的恢復(fù)。

3 小 結(jié)

國(guó)內(nèi)外研究已經(jīng)證明，miRNA可以通過(guò)外分泌體和微粒的形式釋放出細(xì)胞，并被其他細(xì)胞所再吸收，調(diào)節(jié)其生物學(xué)活性[10]。但是,AMI時(shí)血清中水平發(fā)生改變的miRNA是否以外分泌體或微粒的形式存在？它們是否進(jìn)入其他的細(xì)胞？是否影響了其他細(xì)胞的生物學(xué)活性？這些仍未研究明確，將是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。

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