大腸癌肝轉移相關的間質差異表達基因的篩選

程家樂，姚 敬，彭佳遠，汪 昱

(上海交通大學附屬第六人民醫院普外科,上海200000)

大腸癌是影響人類健康的重要疾病，其發病率在世界范圍內位于第三位。盡管診斷技術和治療方式的不斷改進，每年仍有約100萬人發生大腸癌，并且有60萬人死于該病[1]，約一半大腸癌患者發生遠處轉移，其中通過門靜脈系統肝轉移是主要的轉移途徑[2-3]。故對大腸癌肝轉移的早期發現及早期診斷成為治療的關鍵。大腸癌肝轉移的上皮細胞相關基因目前國內外研究較多，而間質遺傳不穩定基因國外報道較少，國內未見報道。激光捕獲顯微切割和基因芯片兩種新興技術已成為腫瘤研究的重要手段。前者能在顯微鏡直視下通過激光捕獲和顯微切割從異質性組織中得到目的細胞或細胞群，保證了組織的同質性；后者可同時高效率檢測成千上萬個基因，是篩選差異表達基因有力的工具。因此，本實驗聯合應用激光捕獲顯微切割和基因芯片技術篩選大腸癌肝轉移間質相關基因，為臨床早期診斷和靶向治療大腸癌肝轉移奠定基礎。

1 材料與方法

1.1組織標本 于2008年7月至2010年7月由上海市第六人民醫院提供的手術切除大腸癌伴肝轉移及不伴肝轉移原發灶標本各4例。大腸癌非轉移為大腸癌術后2年內未見肝轉移的病例。實驗標本基本信息見表1，所有患者術前均未行化療和放療，術后30 min內取腫瘤組織并與液氮罐保存備用，全部標本均由病理學診斷確診。

表1 大腸癌標本臨床病理資料

mT代表有肝轉移的大腸癌原發灶組織;T代表無肝轉移大腸癌組織;1～4為標本序號

1.2激光捕獲顯微切割與微量RNA提取 標本取出后，用冰凍切片機(德國徠卡儀器公司生產,型號:CM1850 UV)行連續切片，厚度約7 μm，將切片放在56 ℃烘烤過夜，HE染色，室溫待標本干燥后采用激光顯微切割機(Arctururs公司生產,型號:Pix Cell Ⅱ LCM)切割，分離出標本中的間質組織。顯微切割時間不能超過30 min，以免RNA降解。使用Trizol試劑(英杰公司提供,批號:15596026)進行標本微量RNA提取。使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司生產,型號:74104)純化RNA，甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度。根據檢測結果，質量合格的RNA進入下一步實驗。

1.3RNA線性擴增、熒光標記和芯片雜交 質檢合格的RNA樣本，采用單標快速擴增熒光標記試劑盒(安捷倫公司生產,批號:0006081570)進行互補核糖核酸(complementary ribonucleic acid,cRNA)合成，行線性擴增，Cy3單色熒光標記，用紫外分光光度計(安捷倫公司生產，型號:ND-1000)檢測標記后的cRNA質量和熒光標記率，當RNA溶液的A260/A280比值范圍在1.8～2.1之間時，說明RNA純度好。檢測合格的標志物與安捷倫人全基因組表達譜芯片(4×44K 2.0)雜交，洗滌。

1.4芯片檢測資料的分析 采用安捷倫微陣列掃描儀(安捷倫公司生產,型號:G2505B)掃描芯片，將安捷倫芯片特征提取軟件讀出的熒光值導入Agilent Genespring GX軟件中進行數據分析。數據經過標準化后得出大腸癌伴肝轉移原發灶間質和不伴肝轉移大腸癌癌灶間質標記的信號比值(倍數變化)，即為該基因組在大腸癌伴肝轉移原發灶間質和不伴肝轉移大腸癌癌灶間質中變化情況。最后經過T-test檢驗，篩選出倍數變化≥2的基因為表達顯著上調基因，倍數變化≤0.5為表達顯著下調基因。同時將所有差異性表達基因導入Agilent Genespring GX軟件后，得出基因本體學分析和通路分析結果。

1.5實時定量聚合酶鏈反應驗證4個基因的表達 利用激光捕獲顯微切割提取4例大腸癌伴肝轉移原發灶及4例大腸癌不伴肝轉移癌灶的間質組織，使用Trizol試劑(英杰公司提供,批號:15596026)進行標本微量RNA提取。對表達上調骨膜蛋白(Periostin)基因、胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)基因和表達下調的過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator,PGC)、趨化因子配體21(chemokine ligand 21,CCL21)基因進行驗證。

2 結 果

2.1激光捕獲顯微切割后的組織 激光捕獲顯微切割后，間質成功地從組織中分離出來。如圖所示,圖1-1(見封三)為其中1例伴肝轉移大腸癌間質切割后的剩余組織;圖1-2(見封三)為該例伴肝轉移大腸癌切割下來的間質;圖1-3(見封三)為其中1例不伴肝轉移大腸癌間質切割后的剩余組織;圖1-4(見封三)為該例不伴肝轉移大腸癌切割下來的間質。

2.2甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量 由于通過激光捕獲顯微切割獲得的目的細胞數量有限，RNA產量較低，故點樣量相對偏少RNA變性瓊脂糖凝膠電泳，出現28S和18S兩條帶，且28S帶密度約為18S帶密度的2倍，幾乎未出現其他混雜帶(圖2)，據此可判斷RNA質量好，可以進入下一步的實驗。

mT:伴有肝轉移的大腸癌原發灶間質細胞;T：不伴肝轉移大腸癌組織的間質細胞;1～4：標本編號

圖2微量RNA的變性瓊脂糖凝膠電泳

2.3熒光標記的cRNA定量分析 激光捕獲顯微切割所得的總RNA經過線性擴增，紫外分光光度計檢測表明所得的cRNA量為1.70～1.86 μg，大腸癌伴肝轉移原發灶間質和不伴肝轉移大腸癌癌灶間質組織的A260/A280比值介于1.9～2.1之間，說明RNA純度高，熒光標記效率在9 pmol/μg以上可參加雜交反應，RNA基本信息見表2。質量合格，可進入下一步實驗。

表2 大腸癌RNA樣品基本信息

mT:伴有肝轉移的大腸癌原發灶間質細胞；T：不伴肝轉移大腸癌組織的間質細胞

2.4芯片檢測結果 用Cy3分別標記大腸癌伴肝轉移原發灶間質和不伴肝轉移大腸癌癌灶間質，與芯片雜交后掃描圖像，可以看到空白對照點無信號，陰性對照點有弱信號，陽性對照點為強信號。經Agilent Genespring GX軟件分析，背景信號噪音低，證實該實驗可靠。用大腸癌伴肝轉移原發灶間質和不伴肝轉移大腸癌癌灶間質的熒光信號作散點圖，大部分聚集在一個以45°對角線為中心的區域里，表示信號差異在0.5～2.0之間，所有差異性基因均滿足P<0.05(圖3)。

圖3-1 mT1 VS T1 圖3-2 mT2 VS T2

圖3-3 mT3 VS T3 圖3-4 mT4 VS T4

圖3大腸癌肝轉移間質差異表達基因的散點圖其中位于三條基線之間的為表達無顯著差異的基因，位于最上層基線之上的為上調基因，位于最下層基線之下的為下調基因

2.5生物學信息分析 依熒光素大腸癌伴肝轉移原發灶間質/不伴肝轉移大腸癌癌灶間質比值(倍數變化)>2.0或<0.5的數據項差異表達，共篩選出1948條基因發生差異表達，其中上調的有1266條，下調的有682條，將這些基因按基因本體論分析分子功能進行分類，發現這些差異表達基因與細胞分化、酶活性調節，信號轉導及基因轉錄、翻譯調節等有關。按通路分析，發現這些差異基因主要參與細胞外基質受體相互作用、局部黏附、細胞黏附分子、抗原過程和呈遞、細胞因子間相互作用、轉化生長因子β信號通路等通路。

2.6實時定量聚合酶鏈反應驗證結果 基因Periostin、IGF-2在肝轉移的大腸癌間質中均高表達，基因PGC、CCL21在肝轉移的大腸癌間質中均低表達。表3顯示各基因的引物和產物。上述結果與基因芯片的表達結果是一致的(表4)，說明基因芯片結果可靠。

表3 引物列表

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Periostin：骨膜蛋白； IGF-2：胰島素樣生長因子2； PGC：過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子；CCL21：趨化因子配體21

表4 樣品的待測基因相對含量表

mT:有肝轉移的大腸癌間質組織；T：無肝轉移的大腸癌間質組織；mT/T代表基因的相對比值 GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶;Periostin：骨膜蛋白;IGF2：胰島素樣生長因子;PGC：過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子;CCL21：趨化因子配體21

3 討 論

人類的大部分惡性腫瘤都起源于上皮細胞，在正常情況下，起源于上皮細胞層的惡性腫瘤與起支持作用的間質細胞被基底膜分隔。長期以來學者們都認為上皮細胞惡性腫瘤只與上皮細胞相關，其治療方案也只針對上皮細胞本身。然而惡性腫瘤的進展不僅有上皮細胞的癌癥相關變化，作為腫瘤生長微環境的間質細胞在上皮細胞腫瘤的進展中也起了重要的作用[4]。目前上皮與間質細胞在腫瘤進展中的相互作用主要有兩種學說：一種是間質細胞首先發生異常進而導致上皮細胞的變異，另一種是變異的上皮細胞通過旁分泌的方式引起間質的腫瘤相關變化[5]。間質中存在著多種細胞：由內皮細胞、平滑肌細胞、周皮細胞組成的脈管系統為組織輸送氧氣及營養物質[6]，由趨化因子及細胞因子募集的炎性細胞及免疫細胞同時有致癌和抑癌作用[7]，在腫瘤的生長與轉移過程中，間質中處于靜息狀態的纖維母細胞變為活化的纖維母細胞，是上皮與間質旁分泌信號通路的主要調控者[8]。

本研究結合激光捕獲纖維切割和基因芯片兩種技術篩選出了與大腸癌肝轉移相關的腸癌間質基因共1948條，分別為1266條上調基因及682條下調基因。這些基因與細胞分化、酶活性調節、信號轉導、細胞因子間相互作用等相關。并通過實時定量聚合酶鏈反應驗證基因芯片結果，證實基因芯片結果可靠。

研究表明，在乳腺癌[9]、前列腺癌[10]、Wilms瘤[11]中 IGF-2雙等位基因不僅在腫瘤細胞高表達，與腫瘤鄰接的組織中也有一定程度的表達，這些研究提示在腫瘤的進展過程中，IGF-2基因不僅于上皮細胞中高表達，間質細胞可能也會出現高表達。關華鶴[12]研究表明大腸癌組織和癌旁正常組織均出現IGF-2高表達，且大腸癌中IGF-2的高表達與淋巴結轉移呈正相關。這表明IGF-2與結直腸癌的肝轉移密切相關，本研究顯示伴有肝轉移的大腸癌間質中IGF-2表達顯著高于不伴肝轉移大腸癌間質，提示IGF-2于間質中高表達是大腸癌肝轉移的風險因素，其機制還有待進一步研究。

Bao等[13]研究發現Periostin基因在80%的原發結腸癌組織中表達，并在所有肝轉移灶組織中表達，且肝轉移灶中Periostin基因的表達遠高于原發結腸癌組織，這表明Periostin基因高表達與結腸癌肝轉移有密切聯系。Kikuchi等[14]通過免疫組化和電鏡證實Periostin由結腸腺周間質和結腸癌相關的間質細胞分泌。這些研究提示間質中Periostin基因高表達與大腸癌肝轉移有著密切的聯系，本實驗結果應證了這一點，也進一步說明Periostin確實是在間質中表達的基因。

Liang等[15]將PGC-1α基因導入小鼠間質細胞，使該基因于間質高表達，發現導入PGC-1α基因后間質線粒體形成與清除氧自由基的作用增強，這提示PGC-1基因于間質中的表達情況也影響著腫瘤的預后，且PGC-1基因表達下降的致癌作用可能與其降低細胞能量代謝有關。目前研究發現PGC-1的低表達存在于人結腸癌、前列腺癌、乳腺癌組織中[16-18]。然而，間質中PGC-1基因的表達情況與大腸癌肝轉移目前未見報道。本研究結果提示PGC-1在大腸癌肝轉移原發灶間質中低表達，表明PGC-1在大腸癌發生，發展中可能有抑癌作用，還需進一步研究。

Yousefieh等[19]發現，使小鼠前列腺癌間質高表達CCL21基因，利用CCL21的趨化功能，使樹突狀細胞、T細胞等免疫細胞聚集于腫瘤間質可以抑制腫瘤發展和轉移，其中樹突狀細胞作用于記憶性T細胞和初始T細胞，使其變為具有效應的T細胞，可以直接殺死腫瘤細胞。Mumtaz等[20]于2008的研究顯示，大腸癌患者體內的CCL21較正常人呈明顯的低水平表達狀態。可以推斷，大腸癌間質中CCL21基因的表達必然和肝轉移有關，本實驗利用基因芯片篩選到的大腸癌肝轉移間質差異表達基因中CCL21與不伴肝轉移腸癌間質相比低水平表達，提示CCL21有望成為大腸癌肝轉移診斷及免疫治療的分子標志物。

本研究聯合應用激光顯微切割與基因芯片技術成功構建大腸癌肝轉移間質差異表達基因，并用實時定量聚合酶鏈反應驗證了基因芯片的準確性。以上多個差異表達基因，在以往大腸癌肝轉移發生機制研究中報道較少，其在大腸癌肝轉移中的明顯高表達或低表達，說明它們在大腸癌肝轉移癌變過程中可能起了較大作用，至于其具體作用機制尚需進一步研究。下一步研究將從基因組、蛋白質組水平上對重點基因進行大樣本檢測，以確定大腸癌肝轉移發生發展的關鍵分子機制、診斷和治療靶點。

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