串聯(lián)親和純化技術在研究細胞內(nèi)相互作用蛋白質中的應用

劉 俠(綜述)，韋 薇(審校)

(1.廣西醫(yī)科大學研究生院，廣西 530021； 2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，廣西 530021)

隨著基因組計劃的進行，僅了解基因DNA序列及表達已不能解決基因的表達時間、表達量以及蛋白質翻譯后的情況。蛋白質行使的功能多樣化，包括信息傳遞、生物化學反應等，所有的這些功能是通過蛋白質之間的相互作用來實現(xiàn)的。因此，大規(guī)模、全細胞分析蛋白質之間的相互作用，建立細胞內(nèi)蛋白質復合體之間的相互作用網(wǎng)絡，為準確理解蛋白質功能，揭示生命活動的機制提供重要信息。目前用于蛋白質組間相互作用的方法主要有酵母雙雜交、谷胱甘肽巰基轉移酶親和層析、噬菌體展示技術、免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化(tandem affinity purification，TAP)技術和蛋白芯片等及其基于生物信息學的分析方法，各種技術都有其優(yōu)劣，在不同研究中功能互補。以下主要介紹TAP技術及其在細胞系內(nèi)使用時需要注意的問題。

1 TAP技術的特點

1.1TAP技術原理 TAP技術最早由德國Rigaut等[1]發(fā)明，并在鑒定酵母菌蛋白復合物中獲得成功，隨后擴展到其他細胞系及組織[2]。TAP技術基本原理包括：重組構建帶有兩種親和純化標簽的融合靶蛋白，然后轉染到宿主細胞或組織，帶標簽的靶蛋白表達并結合上相關蛋白質后，利用標簽與相應磁珠作用，兩步純化得到相關蛋白質。

1.2TAP技術優(yōu)點 該方法的主要優(yōu)點概括有四方面：①可以在細胞生理狀態(tài)下或者接近生理狀態(tài)表達融合靶蛋白，研究靶蛋白及其未知的相關蛋白復合體，更真實地反映蛋白質在生物體內(nèi)的功能；②經(jīng)過兩次洗脫，降低了非特異蛋白量，相比較于酵母雙雜交更敏感，更少假陽性；③可以反映復雜的蛋白相關性，除了鑒定到直接結合蛋白，亦能檢測到非直接結合蛋白，甚至捕捉到除蛋白質以外的小分子物質。④TAP標簽種類多樣，能根據(jù)研究需要選擇和設計標簽，技術適用廣泛且實用性強。

1.3TAP技術的限制 每種技術在研究方面會有其局限性，TAP技術也不例外。除TAP標簽本身對蛋白質結構的影響外，在構建融合基因導入細胞系中，哺乳動物細胞比酵母的同源重組效率差，而通過瞬時轉染和外源性啟動子穩(wěn)定轉染獲得的融合蛋白呈現(xiàn)高表達，往往會引起細胞生理活動的變異，雖然可以利用這點研究特殊情況下的蛋白相互作用，但過量表達蛋白結合大量的分子伴侶和熱激蛋白而絕緣，出現(xiàn)蛋白非正常折疊，細胞定位變化和細胞應激反應產(chǎn)生大量假陽性相互作用，可能導致實驗結果偏離[3]。

2 TAP技術的應用

2.1TAP技術流程 利用TAP技術鑒定細胞內(nèi)相互作用蛋白質的技術，應用于真核細胞系流程大致如下：首先選取感興趣的靶蛋白質，從細胞或組織中通過聚合酶鏈反應獲得該蛋白質DNA全長，然后選擇含有標簽序列的親本質粒，將靶蛋白的與TAP標簽蛋白的DNA進行重組。如果沒有帶標簽的親本質粒，也可以使用全基因合成將靶蛋白和標簽蛋白的DNA融合入表達載體，使用質粒或者慢病毒轉染至細胞系，選定穩(wěn)定轉染表達帶標簽靶蛋白的細胞株，提取蛋白后純化蛋白復合體，純化的樣本進行質譜分析等后續(xù)研究。

2.2TAP技術的成功應用 Ogawa等[4]首次使用FLAG/HA(influenza hemagglutinin epitope)串聯(lián)親和標簽，在人海拉細胞系內(nèi)使用帶標簽的轉錄因子E2F-6蛋白鑒定到E2F-6與Mga和Max組成的蛋白復合體，進而闡釋該復合體在生物體內(nèi)的功能。Gloeckner等[5]使用StrepⅡ/FLAG標簽在人胚腎細胞HEK293鑒定到Raf(rapidly accelerated fibrosarcoma)和其相互作用蛋白促分裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK1)和14-3-3蛋白；使用該標簽能快速有效地純化目標靶蛋白，并由此建立了該純化標簽的純化標準流程[6]。TAP標簽除了鑒定到相互作用蛋白質，更可以鑒定到蛋白質以外的小分子物質。Nonne等[7]在2010年利用TAP技術上捕獲到mRNA相關的miRNA，使TAP標簽的應用更為廣泛。以下按年份整理了部分TAP標簽在哺乳類,尤其是人類細胞系及其鑒定到的蛋白復合物(表1)。

表1 串聯(lián)親和純化標簽的應用

*：為RNA； NA：沒有數(shù)據(jù)； ProtA：蛋白A免疫球蛋白伽馬結合位點；CBP：鈣調(diào)蛋白結合位點；ProtG：蛋白G免疫球蛋白伽馬結合位點；SBP：鏈霉親和素結合位點；His：多組氨酸結合位點；biotin：生物素；StrepⅡ：兩個鏈霉素親和位點；MYC：MYC結合位點；HA:influenza hemagglutinin epitope;S-tag：S肽標簽；MEF2-A蛋白:肌細胞增強因子2抗原；Ku70,Ku80:DNA依賴蛋白激酶調(diào)節(jié)亞單位；NPM-ALK:間變性淋巴瘤激酶核磷酸蛋白融合蛋白；WT1:Wilms腫瘤基因；Zcchc8:鋅指8；Raf:加速纖維肉瘤蛋白，rapidly accelerated fibrosarcoma；MEK1:促分裂原活化蛋白激酶；14-3-3:14-3-3蛋白；TRF2:端粒重復序列結合因子2；E2F-6:一種真核細胞轉錄因子；Smad2:絲氨酸/蘇氨酸激酶受體2；Smad3:絲氨酸/蘇氨酸激酶受體3；TRF1:端粒重復序列結合因子1;TIN2:TRF1作用核蛋白2；PP2A:蛋白磷酸酶2；GABA(B):γ-氨基丁酸；pre-40S:預成熟核糖體亞基40；Btk:酪氨酸蛋白激酶；HDGF:肝癌衍生生長因子；HATH:肝癌衍生生長因子同源氨基末端；ADAP:黏附脫顆粒促進適配蛋白

3 應用TAP技術中需注意的問題

3.1常用的TAP標簽及其選擇 隨著TAP技術的發(fā)展，越來越多的標簽供不同串聯(lián)組合[3]，常見的TAP標簽有鈣調(diào)蛋白結合肽、蛋白A免疫球蛋白伽馬結合位點(IgG binding domains of protein A,ProtA)、His、FLAG、StrepⅡ和鏈霉抗生物素蛋白結合肽等，在選擇上需要考慮的問題包括：純化回收率、純度、對融合蛋白的結構和生物學的影響，以及成本。因此，標簽的大小、TAP標簽之間有無酶切位點，TAP標簽的親和率和洗脫條件等都是需要注意的要點。

在最開始的實驗中，由于TAP標簽體積對靶蛋白影響明顯，融合蛋白出現(xiàn)表達變異，蛋白質空間結構改變使其性狀無法表達，蛋白質功能的改變。通過小TAP標簽可以改善由于親和標簽分子質量太大對靶蛋白的影響，目前最小的TAP標簽組合的分子質量僅有3×103。此外,把TAP標簽加在不同的末端也可能改善對靶蛋白的影響。Cipak等[21]報道，在TAP標簽和靶蛋白之間加入柔性片段可以有效降低TAP標簽帶來的負面影響。

TAP標簽及對純化柱的親和指數(shù)越高，結合到純化柱上的概率越大，但同時洗脫回收率可能下降，對于難以培養(yǎng)的細胞系需要選擇高回收率的TAP標簽，如FLAG。對于那些容易降解的靶蛋白，則應選擇洗脫條件溫和的TAP標簽，如鏈霉親和素結合位點(streptavidin-binding peptide,SBP)。需多者兼顧的可以考慮使用StrepⅡ標簽。多組氨酸結合位點(Polyhistidine,His)作為商業(yè)純化蛋白是使用最多的標簽之一[22]，因其苛刻的洗脫條件，可以用于檢測細胞蛋白經(jīng)交聯(lián)處理后的瞬時作用或者較弱的相互作用蛋白質[23]。

酶切位點作為TAP標簽之間的連接，煙草蝕紋病毒酶切位點(tobacco etch virus，TEV)最為常見，另外還有人鼻病毒酶切位點HRV 3C蛋白酶[20]。TEV蛋白酶高效特異，基本不含其他細胞蛋白識別點，使用TEV蛋白酶切掉相關蛋白質的概率極低，可以在第一步純化洗脫條件苛刻情況下使用，不同的標簽在第一步可以使用同樣的洗脫方法。標簽的改良和純化條件的改善使標簽對靶蛋白影響減少，可不用酶切位點，這樣的優(yōu)點是不擔心TEV酶的污染，但要求兩步純化的標簽在洗脫時都比較溫和。

3.2重組蛋白標簽融合的位置 融合標簽加在靶蛋白的N端還是C端，需要根據(jù)靶蛋白的特點，例如蛋白功能區(qū)域結合位點、信號肽、加工剪切位置和蛋白的三維結構等選擇TAP標簽加入的位置。多數(shù)實驗初始設計兩條融合蛋白，來應對可能無法順利表達的問題。如果有融合基因構建后的mRNA水平與實際蛋白表達量不相符的情況出現(xiàn)，可能導致無法用TAP標簽抗體檢測并純化，則需更換TAP標簽位置。

3.3重組蛋白過表達和內(nèi)源性蛋白競爭的問題 實現(xiàn)融合靶蛋白內(nèi)源水平的表達和去除內(nèi)源性蛋白競爭一直是TAP技術運用在真核細胞，尤其是哺乳動物體系的難題。目前最多使用反轉錄病毒穩(wěn)定轉染使蛋白質表達量接近生理表達量，或者用RNA干擾獲得穩(wěn)定表達生理量水平的帶標簽蛋白質。另有研究利用基于蛻皮素及其受體的可控誘導表達系統(tǒng)，根據(jù)需要調(diào)整蛻皮素類似物的添加量調(diào)整融合蛋白的表達水平[24]。對于內(nèi)源性蛋白競爭，F(xiàn)orler等[25]使用RNA干擾和TAP結合建立的干擾TAP，選擇果蠅相應蛋白同源的人類蛋白做誘餌，用雙鏈RNA沉默果蠅的內(nèi)源基因，然后再穩(wěn)定轉染表達外源基因。還有利用轉基因或使用TAP重組基因小鼠[26]，但因為成本高、時間長，無法實現(xiàn)高通量化。

4 展 望

TAP技術屬于蛋白質組學中“Bottom-up”策略之一，對研究蛋白質功能有很強的實用性。TAP技術聯(lián)合質譜對純化后的蛋白質進行分析，通過生物信息學獲得的蛋白相關性可信度高，為后續(xù)的驗證工作節(jié)省大量時間。TAP和酵母雙雜交得到的蛋白相互作用圖譜中重合性不高，各技術策略側重點不同，TAP技術傾向于蛋白在細胞自然生理條件下的功能和相互作用，除了檢測直接相互作用蛋白，更可捕獲間接相互作用蛋白，從而發(fā)現(xiàn)復雜的蛋白復合體。TAP技術同其他方法獲得的數(shù)據(jù)進行補充印證，不斷完善蛋白質相互作用圖譜。TAP技術作為研究相互作用蛋白有不可替代的作用，該技術聯(lián)合質譜技術將是蛋白質組學研究中發(fā)現(xiàn)蛋白功能，揭示復雜蛋白作用網(wǎng)絡的重要手段。

[1] Rigaut G,Shevchenko A,Rutz B,etal.A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration[J].Nat Biotechnol,1999,17(10):1030-1032.

[2] Cox DM,Du M,Guo X,etal.Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells[J].Biotechniques,2002,33(2):267-268.

[3] Li Y.The tandem affinity purification technology:an overview[J].Biotechnol Lett,2011,33(8):1487-1499.

[4] Ogawa H,Ishiguro K,Gaubatz S,etal.A complex with chromatin modifiers that occupies E2F-and Myc-responsive genes in G0 cells[J].Science,2002,296(5570):1132-1136.

[5] Gloeckner CJ,Boldt K,Schumacher A,etal.A novel tandem affinity purification strategy for the efficient isolation and characterisation of native protein complexes[J].Proteomics,2007,7(23):4228-4234.

[6] Gloeckner CJ,Boldt K,Schumacher A,etal.Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag[J].Methods Mol Biol,2009,564:359-372.

[7] Nonne N,Ameyar-Zazoua M,Souidi M,etal.Tandem affinity purification of miRNA target mRNAs (TAP-Tar)[J].Nucleic Acids Res,2010,38(4):e20.

[8] Burckstummer T,Bennett KL,Preradovic A,etal.An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells[J].Nat Methods,2006,3(12):1013-1019.

[9] Wang P,Wu F,Ma Y,etal.Functional characterization of the kinase activation loop in nucleophosmin (NPM)-anaplastic lymphoma kinase (ALK) using tandem affinity purification and liquid chromatography-mass spectrometry[J].J Biol Chem,2010,285(1):95-103.

[10] Tsai A，Carstens RP.An optimized protocol for protein purification in cultured mammalian cells using a tandem affinity purification approach[J].Nat Protoc,2006,1(6):2820-2827.

[11] Gustafson MP,Welcker M,Hwang HC,etal.Zcchc8 is a glycogen synthase kinase-3 substrate that interacts with RNA-binding proteins[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,338(3):1359-1367.

[12] Giannone R,McDonald WH,Hurst G,etal.Dual-tagging system for the affinity purification of mammalian protein complexes[J].Bio Techniques,2007,43(3):296-302.

[13] Brown KA,Ham AJ,Clark CN,etal.Identification of novel Smad2 and Smad3 associated proteins in response to TGF-beta1[J].J Cell Biochem,2008,105(2):596-611.

[14] Ye JZ,Hockemeyer D,Krutchinsky AN,etal.POT1-interacting protein PIP1:a telomere length regulator that recruits POT1 to the TIN2/TRF1 complex[J].Genes Dev,2004,18(14):1649-1654.

[15] Glatter T,Wepf A,Aebersold R,etal.An integrated workflow for charting the human interaction proteome:insights into the PP2A system[J].Mol Syst Biol,2009,5:237.

[16] Bartoi T,Rigbolt KT,Du D,etal.GABAB receptor constituents revealed by tandem affinity purification from transgenic mice[J].J Biol Chem,2010,285(27):20625-20633.

[17] Wyler E,Zimmermann M,Widmann B,etal.Tandem affinity purification combined with inducible shRNA expression as a tool to study the maturation of macromolecular assemblies[J].RNA,2011,17(1):189-200.

[18] Li Y,Franklin S,Zhang MJ,etal.Highly efficient purification of protein complexes from mammalian cells using a novel streptavidin-binding peptide and hexahistidine tandem tag system:application to Bruton′s tyrosine kinase[J].Protein Sci,2011,20(1):140-149.

[19] Zhao J,Yu H,Lin L,etal.Interactome study suggests multiple cellular functions of hepatoma-derived growth factor (HDGF)[J].J Proteomics,2011,75(2):588-602.

[20] Lehmann R,Meyer J,Schuemann M,etal.A novel S3S-TAP-tag for the isolation of T-cell interaction partners of adhesion and degranulation promoting adaptor protein[J].Proteomics,2009,9(23):5288-5295.

[21] Cipak L,Spirek M,Novatchkova M,etal.An improved strategy for tandem affinity purification-tagging of Schizosaccharomyces pombe genes[J].Proteomics,2009,9(20):4825-4828.

[22] Hellman LM,Zhao C,Melikishvili M,etal.Histidine-tag-directed chromophores for tracer analyses in the analytical ultracentrifuge[J].Methods,2011,54(1):31-38.

[23] Woodcock SA,Jones RC,Edmondson RD,etal.A modified tandem affinity purification technique identifies that 14-3-3 proteins interact with Tiam1,an interaction which controls Tiam1 stability[J].J Proteome Res,2009,8(12):5629-5641.

[24] Holowaty MN,Zeghouf M,Wu H,etal.Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7[J].J Biol Chem,2003,278(32):29987-29994.

[25] Forler D,Kocher T,Rode M,etal.An efficient protein complex purification method for functional proteomics in higher eukaryotes[J].Nat Biotechnol,2003,21(1):89-92.

[26] Zhou D,Ren JX,Ryan TM,etal.Rapid tagging of endogenous mouse genes by recombineering and ES cell complementation of tetraploid blastocysts[J].Nucleic Acids Res,2004,32(16):e128.