呼吸道病毒分離培養檢測技術的研究進展

蔣荷萍(綜述)，蔣永林(審校)

(宜興市第二人民醫院檢驗科，江蘇 宜興 214221)

急性呼吸道感染可引起多種臨床疾病，每年造成大量嬰幼兒及兒童的死亡[1]，同時也給社會造成了比較嚴重的經濟負擔[2]。據統計，70%～80%的上呼吸道感染是由病毒引起的，至少有7個科、10多類，共239個型別的病毒可引起急性呼吸道感染[3-4]。由于呼吸道病毒所引發疾病的臨床癥狀比較相近，難以區分從而進行準確診治。因此，準確而有效的呼吸道病毒診斷方法對呼吸道疾病的控制至關重要。傳統的病毒分離培養法一直被譽為病毒檢測的“金標準”，但其一直因耗時長、耗費人力且靈敏度差而應用越來越少[5]。近年來，傳統的病毒分離培養也有了很多新的發展及改進。該文就呼吸道相關的病毒培養發展進行綜述，總結病毒培養中的新方法。

1 傳統方法

自1913年牛痘病毒被首次使用細胞培養的方法培養出來至今已有100年的歷史，病毒分離培養法一直被譽為病毒鑒定的“金標準”[6]。方法發展之初，實驗室一般使用自制培養液及長頸瓶或試管，現各樣培養液均已有售。呼吸道病毒培養常用的培養細胞有人肺癌細胞(A549)、貂肺上皮細胞(Mv1Lu)、馬丁達比犬腎細胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)。根據不同的樣本，不同的病毒培養時間有所不同，一般從數日到2周不等。經典的培養分離鑒定通過觀察細胞病毒效應(cytopathic effect,CPE)來確認病毒的生長情況。除個別病毒外，大多數病毒培養中，CPE的出現一般需要5～10 d，而且不易觀察。因此,呼吸道病毒(如流感病毒，副流感病毒等)多使用血細胞凝集試驗及血凝集抑制試驗來進行檢測，利用此類病毒在被其感染的細胞上表達一種可使紅細胞凝集的蛋白[7]。有研究發現，在接種甲型與乙型流感病毒12 h后，胎兒肺細胞會發生紅細胞凝集反應[8]。CPE與血細胞凝集試驗方法是目前在病毒培養中最常用的病毒檢測方法。病毒分離培養法可以分離檢測多種病毒，而不像其他方法，一般僅局限于一種病毒的檢測。據報道，對于呼吸道病毒，呼吸道病毒混合感染的患者占5%～10%[9]。而且雙重感染更易引起嚴重的呼吸道疾病。所以準確地診斷所有病毒對疾病的診治十分重要。同時病毒分離培養還可以被用作抗病毒藥物，疫苗的研究，血清分型及流行病學研究等[10]。不可否認的是，傳統培養鑒定法繁瑣、費時，診斷效率低，因此尋求新的發展勢在必行[11]。

2 新方法

2.1病毒離心培養法及Pre-CPE檢測 病毒離心培養法又稱病毒殼培養，是在傳統病毒培養基礎上改進的一快速病毒培養方法。此方法是將臨床樣本接種于含有蓋玻片的單層細胞中，經低速離心，以加強病毒對培養細胞的感染性。但離心可以加強病毒對培養細胞侵染性的原因還并不明確，起初有學者認為離心可以加劇病毒與單層細胞的接觸，從而加強侵染，但后來又有研究稱，其原因是離心力對細胞產生脅迫，促進細胞增殖[12]。由于巨細胞病毒在10～30 d才能出現CPE現象，最初離心培養法應用于巨細胞病毒[13]，之后被廣泛地應用于呼吸道病毒，如甲/乙型流感病毒[14-15]、副流感病毒1，2，3型、呼吸道合胞病毒、偏肺病毒[16]的分離檢測。一般情況下，離心培養法是將樣本加置單層細胞中，在(600～700)×g下離心1 h，再加入新的培養液，于35～37 ℃下培養。離心培養法也可使用CPE法進行檢測，但檢測不僅限于CPE方法。可使用基本抗原抗體反應的免疫方法進行檢測，不需要一直等到CPE出現，可使用酶標或熒光標記的單克隆抗體在CPE出體之前進行檢測。因為離心培養法中，在培養的細胞中加入蓋玻片，檢測時可將蓋玻取出進行單克隆抗體染色，為檢測觀察均提供了方便。病毒的離心培養法有以下優勢：適用于難以復制與傳代的病毒，可實現短期復制與檢測；比傳統培養方法耗時短，一般24～48 h內可完成檢測；使用Pre-CPE檢測方法相比CPE而言更加客觀。但也有不足之處，使用單克隆抗體法檢測只能檢測到預想之間的病毒，而預計之外的病毒無法檢測。

2.2混合細胞培養法 混合細胞培養是將兩種或兩種以上細胞混合制成混合的單層細胞，體系中的每種細胞系均保持在單一細胞體系中對病毒的敏感性，這樣可使在同一個培養體系中同時培養多種不同的病毒類型。流感病毒的培養一般使用MDCK，引入其他類型的細胞系可以同時檢測其他常見的呼吸道病毒，這使一次性檢查患者的多種病毒感染成為可能。有研究使用人正常胚胎肺細胞與A549細胞同時檢測腺病毒、巨細胞病毒與單純皰疹病毒，與平行單獨使用一種細胞進行培養相比，腺病毒的靈敏度為93.8%，巨細胞病毒的靈敏度為88.9%，單純皰疹病毒的靈敏度為100%[17]?；旌霞毎囵B多使用Pre-CPE方法進行檢測，使用熒光標記的多種單克隆抗體，同時檢測多種可能感染病毒。目前，混合細胞培養已有商業化產品(Diagnostic Hybrids,Inc.)提供，可供同時檢測多種病毒。R-mix是一項可供培養多種呼吸道病毒的專利混合單層細胞，包括A549及貂肺上皮細胞。使用R-mix細胞進行培養時，同時進行3份單層細胞培養，在培養至18～24 h，使用針對于多種不同病毒的單克隆抗體進行檢測，若為陽性則進行鑒定檢測，若為陰性則在培養48 h后使用單克隆抗體進行檢測。大多數病毒(約98%)在48 h之內可以復蘇，若培養48 h后仍無法用克隆抗體檢測出，則繼續培養5 d左右，至CPE出現[18]。

有研究者分別使用直接抗原檢測法、試管傳統培養法及R-mix方法檢測甲型流感病毒，R-mix的靈敏度為96%，試管傳統培養法為85%，直接免疫熒光檢測法為67%[18]。Fader[19]研究表明，使用R-mix檢測甲型流感病毒的靈敏度顯著高于非培養法抗原免疫層析法。Kim等[20]研究223例樣品發現，使用R-mix混合細胞培養1 d后的陽性率為80%，3 d后為95%，而傳統方法1 d后的陽性率為35%，3 d后為70%。國內有使用自行建立的混合細胞系進行病毒培養分離研究，也取得了較好的效果[21-22]。而Barenfanger等[23]發現，使用R-mix方法檢測到陽性的時間平均為1.4 d，而使用傳統試劑管培養法檢測到陽性的平均時間是5.2 d。R-mix細胞可以培養比較難以分離的病毒，如SARS冠狀病毒[24]。由于SARS冠狀病毒有高危性，為了減少可能培養出SARS冠狀病毒的風險，可使用R-mix Too細胞系，其為MDCK細胞與A459細胞的混合細胞系，對呼吸道病毒敏感，但不能培養SARS冠狀病毒。R-mix與R-mix Too細胞系為常見呼吸道病毒的分離培養提供了簡便可行的方法，這使病毒培養實驗室無需儲存準備多種細胞系，可供傳統培養、離心培養、Pre-CPE檢測使用。

2.3使用轉基因細胞進行病毒分離培養 為了同時增進檢測的準確性與檢測速度，轉基因細胞被應用到病毒培養中。其技術原理是將某種特定的基因轉入細胞，當某種特定的病毒侵入細胞時，會促發某種機制，導致產生一種易于測定的酶。這些特定的基因一般由病毒、細菌或一些細胞資源中獲得，這些一般被稱作病毒報告基因。這種轉基因細胞有一個啟動子，在未被病毒侵染時，其是沉默的，可以被特定的病毒反式激活蛋白激活，但不能被其他病毒激活。早在1980年，就有報道研究有關人類免疫缺陷病毒1型病毒的轉基因細胞系研究，但研究存在一些缺陷，沒能成功應用[25]。轉基因細胞的首次成功應用是用鼠L-細胞培養鑒定脊髓灰質炎病毒[26]。轉基因細胞比較廣泛地應用于單純皰疹病毒、腸病毒。應用于呼吸道病毒是使用人腎胚293T細胞，通過非翻譯區的流感病毒A/WSN/33型的核蛋白來表達RNA轉錄編碼的綠色熒光蛋白與螢火蟲蛋白。報告基因活性于流感病毒感染6 h后激活后進行表達，通過化學發光法來檢測熒光素酶。因為此系統需要病毒侵染的細胞才能檢測到陽性，不像其他檢測系統可檢測到感染與非感染的病毒，所以其特異性更強。例如分子檢測方法可以檢測到感染與未感染的病毒，但此種檢測方法對未預計的病毒同樣難以檢測。

3 小 結

隨著世界醫學水平的快速發展，病毒檢測的方法越來越多，核酸檢測技術、免疫學方法檢測技術等各項技術層出不窮。尤其是聚合酶鏈反應檢測方法，憑借其操作簡便、靈敏度高的優勢得到了廣泛的應用。而病毒分離培養法雖一直被稱為是病毒鑒定的“金標準”，但存在靈敏度低、耗時耗力等弊端。隨著生物學技術的不斷發展，傳統的病毒分離培養技術也出現了多種新的進步，提高了該方法的實用性。近年來，其他各種病毒檢測方法已經朝著自動化程度高的方向發展，因此病毒培養法也必將朝著自動、廉價、快捷的方向前行。

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