磁珠富集法篩選蘭州鲇微衛星分子標記

魏大為連總強吳旭東王發新肖 偉張利平

(1. 甘肅農業大學動物科學技術學院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區水產研究所, 銀川 750001; 3. 寧夏漁業工程技術研究中心, 銀川 750001)

磁珠富集法篩選蘭州鲇微衛星分子標記

魏大為1,2,3連總強1,2,3吳旭東1,2,3王發新1,3肖 偉2,3張利平1

(1. 甘肅農業大學動物科學技術學院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區水產研究所, 銀川 750001; 3. 寧夏漁業工程技術研究中心, 銀川 750001)

蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)又名黃河鯰, 隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridea)、鲇屬(Silurus), 是我國黃河中上游特有的大型經濟魚類。肉質細嫩、少刺、味道鮮美, 具有很高的營養價值, 俗有“黃河鯰魚活人參”之稱[1]。但由于過度捕撈、水利工程等因素, 蘭州鲇野生種群數量日益減少, 已被《中國物種紅色名錄》列為瀕危物種[2]。

微衛星(Microsatellite)是一類廣泛存在于真核生物基因組中具有高度變異性的簡單重復DNA序列[3], 它們多以2—6個堿基序列為核心單位, 串聯排列, 序列長度為幾十至幾百個堿基[4]。由于微衛星具有共顯性、多態性豐富、雜合度高、基因型可快速簡便檢測等優點[5], 目前廣泛應用于物種遺傳結構研究[6,7]、遺傳多樣性分析[8]、遺傳圖譜構建[9]和QLT定位分析[10]等領域。

2003年寧夏回族自治區水產研究所攻克蘭州鲇人工繁育技術難題, 已是具有規?；m州鲇繁育能力的國家級現代種業示范場, 促進了這一特有、珍稀魚類資源保護和大面積養殖。但目前所養殖的蘭州鲇絕大部分是未經選育的自然群體, 遺傳分化較大, 個體生長差異大, 對養殖環境適應性差。因此, 充分了解蘭州鲇種群結構、遺傳多樣性現狀, 開展種質資源保護和人工選育工作十分必要。目前, 關于蘭州鲇的研究主要集中在苗種繁殖、生理生化、營養需求、毒理抗性等方面[11—13], 利用分子標記方法對其種群結構、遺傳多樣性的研究較少。本研究應用磁珠富集法篩選蘭州鲇微衛星分子標記, 旨在為開展蘭州鲇種質資源保護、遺傳圖譜構建及人工選育等工作提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

采集寧夏回族自治區水產研究所全國現代漁業種業示范場(106°22′2″ E, 38°34′ 47″ N)30尾蘭州鲇尾鰭樣本, 無水乙醇–20℃保存。接頭序列(MseI A: 5′-TACTCAGGACTC AT-3′; MseI B: 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′)、MseI-N引物(5′-GATGAGTCCTGAGTAA (N) -3′)、生物素標記探針(AC)12、(AG)12、(ATC)8、(AAAC)8、(AGAT)8均由上海生物工程有限公司合成, pMD19-T載體、鏈霉親和素磁珠購自promega公司, 感受態細胞E.coli DH5α為寧夏水產研究所實驗室保存。

1.2 特定大小DNA片斷篩選

采用苯酚-氯仿法提取蘭州鲇基因組DNA, 取20 μL 100 ng/μL基因組DNA加入5 U的內切酶MseI 37℃、酶切3.5h, 1.8%瓊脂糖凝膠電泳回收200—800 bp DNA片段。將終濃度為20 μmol/L的MseI A和MseI B接頭等比例混合, 94℃變性8min, 緩慢降至室溫制備成連接接頭; 連接酶切回收片段, 16℃過夜, 連接混合液稀釋1/10倍, 以MseIN為引物PCR預擴增, 獲取特定大小DNA片段。

1.3 生物素探針雜交

取上述PCR產物24 μL, 94℃下變性8min, 加入70 μL 65℃雜交緩沖液6×SSC+0.1%SDS和6 μL生物素標記探針, 65℃反應30min, 冷卻至室溫加入300 μL TEN100buffer混勻, 4℃保存。

1.4 磁珠富集

取1—2 mg鏈霉親和素磁珠, 加入300 μL TEN100buffer室溫洗滌3次, 每次3min。磁力架固定磁珠棄去上清液,用60 μL TEN100buffer重懸磁珠后加入雜交液, 室溫反應30min, 待磁珠吸附完畢, 固定磁珠移去雜交混合液。300 μL TEN1000室溫洗滌3次, 洗去與磁珠非特異性結合的DNA片段, 再用300 μL的0.2×SSC+0.1%SDS室溫洗滌磁珠3次。最后加入80 μL TE, 94℃變性8min, 固定磁珠吸取上清液, 獲取單鏈目的DNA片段。

1.5 單鏈DNA片段PCR擴增

以單鏈目的DNA片段為模板, PCR擴增獲得雙鏈目的DNA片段。PCR反應體系20 μL: MseI-N引物

(10 μmol/L) 1 μL, 10×Buffer(含Mg2+) 2 μL, dNTPs

(10 μmol/L) 1.6 μL, 模板DNA 20 ng, Taq聚合酶(5 U/μL) 0.2 μL, 去離子水10.2 μL。PCR反應條件為: 94℃預變性3min, 94℃變性1min, 53℃退火1min, 72℃延伸1min, 經N(N=25、30、34、36)個循環, 確定最佳循環次數。72℃延伸5min, 擴增產物4℃保存。

1.6 T-載體連接、轉化與陽性克隆篩選

PCR產物回收純化, 連接到pMD19-T載體中, 轉入大腸桿菌DH5α菌株, 涂布于含Amp的LB固體培養基上, 構建蘭州鲇微衛星富集文庫。富集文庫經藍白斑篩選, 挑取陽性克隆至含有Amp的LB液體培養基37℃過夜。以菌液為模板, 以M13(+)、M13(–)通用引物和不含有生物素的探針序列作為雙引物進行PCR擴增, 擴增產物經瓊脂糖電泳檢測, 挑取目的條帶(100—800 bp)中含有兩條或兩條以上條帶的陽性克隆測序。

1.7 引物設計、篩選與多態性分析

測序結果用軟件 MEGA4.0構建系統發育樹去掉同源序列; 用 SSRHunter設定參數(重復元件的核苷酸數最多為6個, 最少重復次數為4次), 查找微衛星序列, 并人工檢查核對后提交 GenBank; 挑選兩側翼區均足夠長的微衛星序列, 設計引物進行PCR擴增。PCR反應體系25 μL: 10×Buffer(含Mg2+)3.0 μL, dNTPs(10 μmol/L)2.0 μL, 模板DNA 20 ng, 上游、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, Taq聚合酶(5 U/μL)0.2 μL, 無菌超純水補足總體積至25 μL。PCR反應程序: 94℃預變性5min, 94℃變性30s, 退火30s,退火溫度依引物而異, 72℃延伸1min, 34個循環; 72℃延伸10min, 4℃保存。擴增產物先經瓊脂糖凝膠法檢驗, 再用8%聚丙烯酰胺凝膠銀染法檢測, 利用pBR322顯示微衛星條帶的大小。利用Popgene version1.32(http//genepop. curtin.edu.au/)統計各微衛星標記等位基因的數目、基因雜合度和多態信息含量。

2 結果

2.1 微衛星片段富集

本研究選用內切酶 MseI對基因組 DNA進行酶切,酶切片段均勻彌散, DNA已完全被酶切。PCR預擴增特定DNA片段在30個循環后電泳檢測, 結果顯示在200—800 bp處出現Smear區域(圖1), 說明可滿足構建微衛星DNA文庫的需要。

圖1 基因組DNA、酶切與預擴增產物電泳結果Fig.1 The electrophoresis of genomie DNA, digested by enzyme MseI and PCR amplification

圖2 PCR擴增單鏈目的片段不同循環次數電泳結果Fig. 2 The electrophoresis by different PCR cycles

以MseI-N為引物, 分別設置單鏈目的DNA片段25、30、34和 36個循環擴增, 結果顯示 36個循環獲得雙鏈目的片段效果最佳。親和捕捉的目的片段主要集中在200—500 bp左右, 而800 bp以上的較少, 與酶切回收片段基本相符(圖2)。將富集的微衛星DNA片段與pMD19-T載體連接, 轉化至大腸桿菌DH5α菌株進行克隆, 經藍白斑初步篩選獲得含有微衛星序列(電泳結果是兩條或者兩條以上的條帶)的500個陽性克隆(圖3), 隨機選取300個克隆測序分析。

圖3 微衛星序列陽性克隆電泳檢測結果Fig. 3 Representing recombined positive clones containing microsatellite sequence

2.2 微衛星富集文庫鑒定

測序結果依據 Linda，et al.[14]關于微衛星劃定標準進行微衛星文庫鑒定, 結果顯示 158個(52.7%)克隆符合微衛星界定標準, 序列比對去掉同源序列共獲得 121個微衛星序列(GenBank 中序列登錄號: KJ008462-KJ008582)。依據Weber[5]制定的標準, 121個微衛星序列中完美型62個(51.2%)、非完美型27個(22.3%)、混合型為 32個(26.5%)(圖 4); 重復次數主要分布在 16—20次,重復30次以下的比例為80.16%(圖5)。

圖4 蘭州鲇微衛星序列特征分布Fig. 4 Characteristic of microsatellite types in S. lanzhouensis

圖5 蘭州鲇微衛星重復次數的頻率分布Fig. 5 Percentage of microsatellite repeat numbers in S. Lanzhouensis

2.3 微衛星標記篩選與多態性分析

根據側翼序列長短, 在 121個微衛星序列中共設計出90對引物。隨機選取其中 30對, 進行蘭州鲇微衛星標記位點篩選與多態性分析。30個蘭州鲇試驗樣本中篩選出 17對多態性引物, 每對引物等位基因數(Na) 2—6個(平均 3.47), 觀測雜合度(Ho) 0.0972—0.7326(平均 0.4118), 期望雜合度(He)0.1862—0.8483(平均0.6103), 多態信息含量(PIC) 0.1638—0.7945(平均0.5345), 詳見表1。

3 討論

磁珠富集法制備微衛星文庫具有快速、便捷、效率高、成本低、所獲微衛星質量高等特點, 是一種值得推薦的微衛星制備方法[15]。但是操作過程中的一些因素會影響篩選微衛星的效率, 優化親和素磁珠與生物素探針-微衛星復合體的吸附條件, 使其高效捕捉是構建文庫的關鍵。磁珠的平衡、洗滌時間和洗滌溫度都要嚴格控制, 整個操作過程要輕柔, 以達到最佳的分離效率。

Kruglyak, et al.[16]的研究發現, 在大多數真核生物中微衛星重復單元主要是二核苷酸(AC/TG)n, 兩堿基重復序列類型的多態性最高, 其次為三堿基, 再次為四堿基。李齊發等[17]選擇(CA)12、(CAG)8、(CCG)8和(TTTC)8探針富集牦牛(Bos grunniens)微衛星, Barker, et al.[18]以(CT)n、(AG)n、(CA)n、(AAT)n和(ATT)n探針富集黃花柳(Salix burjatica)微衛星, 魯翠云等[19]選擇(CA)15、(AG)12、和(AAG)8探針富集鳙魚(Aristichthys nobilis)微衛星, 劉臻等[20]以(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8和(GATT)7探針富集黃顙魚(Pseudobagrus fulvidraco)微衛星, 本研究用(AC)12、(AG)12、(ATC)8、(AAAC)6和(AGAT)6混合探針富集蘭州鲇微衛星, 均成功篩選到各種類型的多態性微衛星標記。因此在今后的研究中使用多種探針來篩選增加微衛星種類是可行的。

本研究篩選到的微衛星序列, 除探針使用的 AC、AG、ATC、AAAC和AGAT重復單元外, 還發現GTCT、TTCT、TTCC、TGTC、CTCA、TTTC重復序列的微衛星類型。121個微衛星序列中完美型62個(51.2%)、非完美型 27個(22.3%)、混合型為 32個(26.5%); 這一結果與白鰱(Hypophthalmichtys molitrix)[21]、哲羅魚(HuchotaiMen Pallas)[22]、黃顙魚(Pseudobagrus fulvidraco)[20]以及大黃魚(Pseudosciaena croce)[23]的微衛星序列特點基本相符, 其中蘭州鲇微衛星中, 非完美型和混合型比例略高; Santibanez, et al.[24]研究表明生物生存環境的變化會導致其微衛星重復次數和長度發生變化, 當生態環境適宜于其生存發展時,復制滑移(Replication slippage)頻率較高, 使微衛星重復次數增加、長度變長, 完美型比列較高。當生態環境不適宜于其生存發展時, 點突變頻率較高, 使微衛星重復序列中斷, 阻礙長度增加, 非完美型比列增加。本次研究篩選到的蘭州鲇非完美型和混合型微衛星序列較為豐富,造成這一結果的原因可能與蘭州鲇的進化及環境變遷有關; 有學者認為鯰類祖先為早白堊紀時鼠目(Gonorynchiformes), 經晚白堊紀復雜的地理變遷, 鼠目衍生出原始的鯉類和鯰類, 并獨立分化形成了若干不同的類群,逐漸從非洲向歐亞大陸擴展, 經過很長的一段時間后, 新的類群和新種又不斷分化出來。在較近的地質時期, 鯰科的鯰屬似乎在我國的西南地區發生過更次級的分化[25,26]。這一系列自然環境的變遷及人為因素, 使蘭州鲇棲息范圍越來越窄, 迫使其基因組在復制傳遞過程中造成更多的變異, 增加其遺傳多樣性, 以緩解生存壓力。

本研究中獲得17對多態性微衛星標記的平均等位基因數為3.47, 與吳旭東等[27]利用12對大口鲇微衛星標記進行蘭州鲇個體遺傳結構分析所得平均等位基因數7.92相比較小。蔣鵬等[28]研究表明等位基因的數目反映了該位點在進化過程中積累的遺傳變異程度, 等位基因數越多說明進化歷程這個位點突變越活躍, 物種在自然選擇中發展的取向越大, 對生活環境的適應潛能越大。這一結果說明不同的微衛星標記位點, 檢測到的等位基因數目不同, 代表的遺傳信息量也有所差異。本次篩選到的17對多態性微衛星位點在蘭州鲇進化過程中積累的遺傳變異程度較小, 在進化歷程中這些位點突變較活躍。

多態信息含量(PIC)是衡量微衛星多態性的重要指標[3]。Bacon, et al.[29]研究發現, 微衛星的多態性(或變異性)與其長度有關, 不完美型微衛星的變異性應比完美型低。本次檢測17對多態性微衛星位點中, 7對完美型平均多態信息含量為0.6613, 2對不完美型平均多態信息含量為0.4623, 8對混合型平均多態信息含量為0.4313, 三種類型的多態信息含量平均值差異極顯著(P＜0.01), 完美型多態信息含量顯著的高于不完美型和混合型。這一結果說明蘭州鲇完美型微衛星標記比不完美型微衛星標記多態性高,與鄭燕等[30]在水稻(Oryza sativa)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)的研究結果一致。但是研究發現在大多數植物上五核苷酸重復完整型的多態性略低于不完整型, 表現出獨有特殊性[34]。在水產動物是否也存在這種現象, 有待深入研究。

蘭州鲇是名貴黃河魚類, 具有較高的經濟價值, 人工馴養已取得成功, 推廣應用前景廣闊。本研究構建了蘭州鲇基因組微衛星文庫, 獲得了大量可利用的微衛星序列。隨機設計的30對微衛星引物中17對在蘭州鲇中具有多態性, 多態性引物占 56.7%, 觀測雜合度為 0.0972—0.7326, 期望雜合度為 0.1862—0.8483, 說明微衛星文庫構建較好, 可為下一步進行蘭州鲇種質資源保護、遺傳圖譜構建、標記輔助育種提供大量候選微衛星標記, 并將為蘭州鲇種系評估、經濟性狀的QTL定位等研究奠定基礎。

致謝:

中國科學院院士、中國科學院水生生物研究所研究員桂建芳老師對本課題試驗研究給予指導和幫助, 在此表示誠摯的謝意。

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MICROSATELLITE ENRICHMENT BY MAGNETIC BEADS IN SILURUS LANZHOUENSIS

WEI Da-Wei1,2,3, LIAN Zong-Qiang1,2,3, WU Xu-Dong1,2,3, WANG Fa-Xin1,3, XIAO-Wei2,3
and ZHANG Li-Ping1
(1. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Ningxia Fisheries Research Institute, Yinchuan 750001; 3. Ningxia Engineering Research Center for Fisheries, Yinchuan 750001, China)

蘭州鲇; 微衛星標記; 磁珠富集; 篩選及特征

Silurus lanzhouensis; Microsatellites; Magnetic bead enriched; Isolation and characterization

Q173

A

1000-3207(2014)04-0791-06

10.7541/2014.110

2014-02-25;

2014-04-19

國家自然科學基金項目(31360633); 國家科技支撐計劃項目(2012BAD25B09)資助

魏大為(1989—), 男, 甘肅通渭人; 碩士研究生; 主要從事動物遺傳與生物技術研究。E-mail: weidaweiwdw@163.com

吳旭東(1967—), 男, 博士, 研究員; 主要從事水生動物分子生物學及種質資源保護與增養殖研究。E-mail: amy95@126.com