鄰苯二甲酸二乙基己酯對(duì)鯉非特異性免疫的影響及遺傳毒性

張貴生

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系, 菏澤 274015)

鄰苯二甲酸二乙基己酯對(duì)鯉非特異性免疫的影響及遺傳毒性

張貴生

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系, 菏澤 274015)

以水和吐溫–80為對(duì)照, 用5、20、80、160 mg/L的鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)對(duì)鯉染毒20d, 研究了DEHP對(duì)鯉非特異性免疫功能的影響及遺傳毒性。結(jié)果表明: 吐溫–80組與水對(duì)照組相比除紅細(xì)胞總核異常率顯著升高外, 所測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)差異均不顯著。80、160 mg/L組白細(xì)胞吞噬活力、吞噬指數(shù), 血清抗菌活力, 溶菌酶活性均顯著低于水對(duì)照組和吐溫–80組(P＜0.05或P＜0.01), 且20 mg/L組白細(xì)胞吞噬活力、吞噬指數(shù)顯著低于水對(duì)照組。與吐溫–80組相比, 160 mg/L組血清C3含量顯著降低, 5、20、80 mg/L組C3含量, 5、20、80、160 mg/L組C4含量則無(wú)顯著性差異。20、80、160 mg/L組C3含量, 160 mg/L組C4含量顯著低于水對(duì)照組(P＜0.05或P＜0.01)。160 mg/L組紅細(xì)胞微核率顯著高于吐溫–80組, 80、160 mg/L組紅細(xì)胞微核率顯著高于水對(duì)照組。在DEHP實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi), 紅細(xì)胞核異常率、總核異常率, 肝細(xì)胞DPC系數(shù)均顯著高于水對(duì)照組和吐溫–80組。一定濃度的DEHP對(duì)鯉具有免疫毒性和遺傳毒性。

鄰苯二甲酸二乙基己酯; 鯉; 白細(xì)胞; 溶菌酶; 抗菌活力; 補(bǔ)體; 微核; DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)

鄰苯二甲酸二乙基己酯(Di-(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP )是應(yīng)用量最大, 使用最廣泛的一種鈦酸酯類化合物(PAEs), 由于其易從塑料中轉(zhuǎn)移出來(lái),污染外界環(huán)境, 在大氣、土壤、食品、飲用水、河流中均檢測(cè)到了此類物質(zhì)的存在, 因此DEHP對(duì)生物體的致毒效應(yīng)也越來(lái)越被人們所重視。有研究表明, DEHP具神經(jīng)毒性[1]、胚胎發(fā)育毒性[2]、生殖毒性[3, 4], 并引發(fā)哮喘[5]。據(jù)報(bào)道,DEHP 含量在不同水域中含量均最高, 但DEHP對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)研究相對(duì)較少, 有研究表明, DEHP可導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎畸形, 孵化率降低[6]等。但DEHP對(duì)免疫系統(tǒng)及魚(yú)類的遺傳毒性效應(yīng)少見(jiàn)報(bào)道, 因此, 本研究選用在我國(guó)分布最為廣泛的鯉(Cyprinus carpio Linnaeus)作為受試動(dòng)物, 研究DEHP對(duì)鯉白細(xì)胞吞噬能力、血清抗菌活力、溶菌酶活性、補(bǔ)體C3、C4含量的影響,研究DEHP對(duì)紅細(xì)胞微核率及肝細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)的影響, 目的是探討DEHP對(duì)魚(yú)類非特異性免疫的影響及遺傳毒性, 這在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道,期望能為DEHP的科學(xué)應(yīng)用, 探討其對(duì)魚(yú)類的毒性作用機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

鯉(Cyprinus carpio Linnaeus), 菏澤市牡丹區(qū)魚(yú)苗養(yǎng)殖場(chǎng)提供, 體重(68.62±3.18) g, 體長(zhǎng)(14.95± 0.62) cm, 在室溫條件下馴養(yǎng)10d。

1.2 儀器及主要試劑

鄰苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)、吐溫–80均為國(guó)產(chǎn)分析純, 金葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)(菏澤市防疫站提供), 補(bǔ)體C3、C4試劑盒(浙江伊利康生物技術(shù)有限公司), 溶菌酶檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所), Hoechst33258熒光染料(BIOSHARP公司), 小牛胸腺 DNA(上海源葉生物科技有限公司), 蛋白酶K(SIGMA公司), 熒光分光光度計(jì)(日立 F-4500) ,低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf-5417R), 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析 TU-1810), 自制玻璃缸(120 cm× 80 cm×60 cm)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理 實(shí)驗(yàn)共分6 組, 水對(duì)照組(不添加吐溫–80及DEHP), 吐溫–80對(duì)照組和5、20、80、160 mg/L 的DEHP組(DEHP先用吐溫–80助溶,配制成120 g/L的母液, 各DEHP處理組均用DEHP母液配制, 吐溫–80對(duì)照組及各DEHP組吐溫–80含量均為80 mg/L, 符合中國(guó)藥典(CP2005)添加標(biāo)準(zhǔn)),實(shí)驗(yàn)在玻璃缸內(nèi)進(jìn)行, 缸內(nèi)處理液均為102 L, 每組設(shè) 3個(gè)平行組, 每組鯉 30尾, 實(shí)驗(yàn)用水為曝氣 2d以上的自來(lái)水, 水質(zhì)符合中國(guó)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(GB 11607—89), 水溫(21±1)℃ , 溶氧量大于6 mg/L, pH 6.5—7.0, 充氧機(jī)不間斷充氧, 自然光照, 每天 8: 00am飼喂一次(飼料購(gòu)自江蘇先驅(qū)飼料科技有限公司),投喂量以20min內(nèi)攝食完畢, 無(wú)剩余為標(biāo)準(zhǔn), 2d換水一次, 每次換去 1/3水量(在處理液 1/3的玻璃缸處做一標(biāo)記, 換處理液時(shí), 用小型水泵抽出致標(biāo)記處, 同時(shí)把食物殘?jiān)痛x廢物吸出, 然后再加入與本組相同濃度的處理液致102 L處), 將鯉浸泡染毒20d。

樣品的采集和制備 染毒20d, 隨機(jī)從每組各取鯉12尾, 尾靜脈處采血, 6尾取血液置于抗凝EP管中, 用于白細(xì)胞吞噬功能的檢測(cè), 一部分分別涂片用于紅細(xì)胞微核率的檢測(cè)。6尾取血液分別置于無(wú)菌EP管中, 于4℃冰箱中放置6h, 1000 r/min離心15min 取血清, 用于溶菌酶活力、補(bǔ)體C3、C4含量及血清抗菌活力的測(cè)定, 解剖鯉取肝臟用于DPC交聯(lián)系數(shù)的測(cè)定。金黃色葡萄球菌的制備: 用5%的福爾馬林對(duì)收集的金黃色葡萄球菌在37℃條件下滅活24h, 生理鹽水洗滌3次, 再用生理鹽水將其濃度調(diào)整至l×108個(gè)/mL, 用作檢測(cè)白細(xì)胞吞噬功能的吞噬菌體。

1.4 非特異性免疫指標(biāo)的測(cè)定

白細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定 將 0.2 mL抗凝血及0.1 mL 滅活的金黃色葡萄球菌懸液加入到EP管中, 搖勻, 25℃孵育1h, 2000 r/min離心10min, 取血漿與紅細(xì)胞交界面的白細(xì)胞做涂片, 自然晾干, 甲醇固定, Giermsa染色 30min, 水洗, 顯微鏡油鏡下隨機(jī)觀察 100個(gè)多形核白細(xì)胞, 記下吞噬菌體的白細(xì)胞數(shù)及吞噬菌體的數(shù)量, 計(jì)算吞噬率(PP)和吞噬指數(shù)(PI)。

PP(%)=(100個(gè)白細(xì)胞中參與吞噬菌體的白細(xì)胞數(shù)/100)×100;

PI=被吞噬的細(xì)菌數(shù)／吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)。

DEHP對(duì)鯉血清溶菌酶活性測(cè)定 以溶壁微球菌凍干粉為底物, 嚴(yán)格按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

DEHP 對(duì)鯉血清補(bǔ)體C3、C4含量的測(cè)定 C3、

C4含量測(cè)定嚴(yán)格按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

ΔAT以空白管吸光度作對(duì)照的樣品管吸光度值; ΔAS以空白管吸光度作對(duì)照的校準(zhǔn)管吸光度值; CS校準(zhǔn)液中C3的濃度; CF校準(zhǔn)液中C4的濃度。

1.5 遺傳毒性指標(biāo)的測(cè)定

DEHP對(duì)鯉紅細(xì)胞微核率及核異常率的測(cè)定每組各取魚(yú)6尾, 斷尾取血, 涂片, 每組制備18 張血涂片, 自然晾干, 甲醇固定, 瑞氏染色, 油鏡下觀察、每個(gè)涂片至少觀察3000個(gè)以上的紅細(xì)胞, 記錄觀察的紅細(xì)胞數(shù), 具微核及核異常的紅細(xì)胞數(shù), 以千分率表示微核率、核異常率和總核異常率。

微核率=微核細(xì)胞總數(shù)/觀察的紅細(xì)胞總數(shù)× 1000‰; 核異常率=核異常的細(xì)胞總數(shù)(微核細(xì)胞數(shù)除外)/觀察的紅細(xì)胞總數(shù)×1000‰; 總核異常率=微核率+核異常率

DPC交聯(lián)系數(shù)的測(cè)定 采用 KCl-SDS沉淀法, 參考徐錢(qián)等和潘魯青等[8,9]方法, 每組隨機(jī)取 6尾鯉, 解剖, 取肝臟, 用眼科剪剪成糜狀(約 1 mm3的組織塊), 3—4層擦鏡紙過(guò)濾, 用PBS (pH=7.5)制成肝細(xì)胞懸液, 血球計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù), 使細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.5×106個(gè)/mL, 取0.5 mL該懸液于2 mL EP管內(nèi), 1800 r/min離心5min, 去掉上清液, 用0.5 mL PBS (pH=7.5)重懸浮細(xì)胞。細(xì)胞的裂解: 將0.5 mL 2%的SDS溶液加入具肝細(xì)胞懸液的 EP管中, 輕微振蕩,于 65℃水浴中 10min, 裂解細(xì)胞。游離 DNA和交聯(lián)DNA的分離: 向裂解細(xì)胞的EP管內(nèi)加入100 μL 1.0 mol/L的KCl (用20 mmol/L、pH=7.5的Tris-HCl溶液配制)溶液。將混合液6次穿過(guò)1 mL聚丙烯槍頭, 冰上放置 5min, 形成大量白色沉淀后, 12000 r/min離心10min, 收集沉淀, 上清液(游離態(tài)DNA)轉(zhuǎn)入一干凈離心管(5 mL)中．再加入 1 mL的清洗緩沖液(0.1 mol/L KCl, 0.1 mmol/L EDTA, 20 mmol/L Tris-HCl, pH=7.5), 重懸浮沉淀, 65℃水浴加熱10min, 冰上驟冷 5min, 如前述離心, 如此清洗 3次, 每次都將上清轉(zhuǎn)入上述 5 mL離心管中。最終的沉淀重懸浮于0.5 mL的清洗緩沖液中, 然后加入0.5 mL的蛋白酶K (0.4 mg/mL, 溶于清洗緩沖液中配制), 50℃消化3h, 從水浴中取出, 冰上驟冷 5min, 13000 r/min 4℃離心 10min收集上清液(其中包括 DPC中的DNA)。并加入1 mL新鮮配制的400 ng/mL的熒光染料Hoechst33258, 使終濃度為200 ng/mL, 置于暗處30min。

DPC系數(shù)的計(jì)算: 制作DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線:用清洗緩沖液配制終濃度分別為0、100、300、500、750、1000、1500、2000、3000、5000 ng/mL的小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)液, 緊接著加入1 mL新鮮配制的400 ng/mL的熒光染料 Hoechst33258, 使終濃度為200 ng/mL, 置于暗處30min。用F-4500型熒光分光光度儀在353 nm激發(fā)光和455 nm發(fā)射光下測(cè)得各濃度的熒光值, 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)。將染色后的樣品用F-4500型熒光分光光度計(jì)測(cè)定其熒光值, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量交聯(lián) DNA和自由 DNA, 再計(jì)算DPC系數(shù)。DPC=交聯(lián)DNA/(交聯(lián)DNA+自由DNA)

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=6)表示。利用SPSS軟件在對(duì)照組和吐溫–80組間, 對(duì)照組、吐溫–80組和各DEHP染毒組間進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA), 兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD), P＜0.05表示差異顯著, P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1DEHP對(duì)鯉非特異性免疫功能的影響

DEHP對(duì)鯉白細(xì)胞吞噬能力的影響 表1顯示, 吐溫–80組與對(duì)照組之間, 5 mg/L DEHP組與水對(duì)照組和吐溫–80組之間吞噬百分率及吞噬指數(shù)差異均不顯著。20、80 mg/L組與水對(duì)照組相比, 顯著降低了吞噬百分率和吞噬指數(shù), 但20 mg/L組與吐溫–80組相比差異不顯著, 80 mg/L組較吐溫–80組表現(xiàn)為顯著降低, 160 mg/L組較水對(duì)照組和吐溫–80組表現(xiàn)為極顯著降低(P＜0.01)。這說(shuō)明, 較低濃度的DEHP對(duì)血液白細(xì)胞吞噬能力影響不顯著, 較高濃度的DEHP則能顯著降低血液白細(xì)胞的吞噬能力。

DEHP對(duì)鯉血清抗菌活力的影響 圖1顯示,吐溫–80組較水對(duì)照組血清抗菌活力略有增強(qiáng), 但差異不顯著。80、160 mg/L DEHP組血清抗菌活力與水對(duì)照組和吐溫–80組相比均顯著降低(P＜0.05),但5、20 mg/L 組與水對(duì)照組和吐溫–80組相比差異不顯著(P＞0.05)。這說(shuō)明較高劑量的 DEHP能顯著降低鯉的血清抗菌活力。

DEHP對(duì)鯉血清溶菌酶活力的影響 圖2顯示, 吐溫–80組與水對(duì)照組之間, 血清溶菌酶活力無(wú)顯著性差異。5、20 mg/L DEHP組與水對(duì)照組和吐溫–80組相比, 血清溶菌酶活力無(wú)顯著性變化,但80、160 mg/L組血清溶菌酶活力均顯著低于水對(duì)照組和吐溫–80組。這說(shuō)明較低濃度的DEHP對(duì)魚(yú)類血清溶菌酶活力影響不顯著, 較高濃度的 DEHP則能顯著降低鯉血清溶菌酶活力。

表1 DEHP對(duì)鯉白細(xì)胞吞噬能力的影響Tab. 1 Effects of DEHP on leucocyte phagocytic ability of carps

圖 1 DEHP對(duì)鯉血清抗菌活力的影響Fig. 1 Effects of DEHP on serum antibacterial activity of carps

圖2 DEHP對(duì)鯉血清溶菌酶活力的影響Fig. 2 Effect of DEHP on lysozyme activity of serum of carps

DEHP對(duì)鯉血清補(bǔ)體C3、C4含量的影響 圖3、圖4顯示, 吐溫–80組血清C3、C4含量均有所降低, 但與水對(duì)照組相比, 差異均不顯著。圖3可看出,與水對(duì)照組相比, 5 mg/L DEHP組補(bǔ)體C3含量略有上升, 但差異不顯著, 20、80 mg/L組顯著降低(P＜0.05), 160 mg/L組極顯著降低(P＜0.01)。血清補(bǔ)體C4含量與水對(duì)照組相比, 5、20、80 mg/L組差異不顯著, 但160 mg/L組顯著降低(P＜0.05)。與吐溫–80組相比, 5、20、80 mg/L組血清C3含量變化不明顯, 但160 mg/L組顯著降低(P＜0.05)。圖4顯示,在DEHP實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi), 與吐溫–80組相比, 血清C4含量均無(wú)顯著性變化。這說(shuō)明, 較高濃度的DEHP能顯著降低血清 C3、C4含量, 其中助溶劑吐溫–80對(duì)血清C3、C4含量的影響也可能起著一定的作用。

2.2DEHP對(duì)鯉遺傳毒性的影響

DEHP對(duì)鯉紅細(xì)胞微核及核異常的影響 表2顯示, 與水對(duì)照組相比, 吐溫–80并不能顯著影響鯉紅細(xì)胞微核率和核異常率, 但卻顯著降低了總核異常率。與水對(duì)照組相比, 5、20 mg/L組微核率無(wú)顯著性變化, 80、160 mg/L組鯉紅細(xì)胞微核率顯著升高。但與吐溫–80組相比只有160 mg/L組顯著提高了紅細(xì)胞微核率, 其他較低劑量的 DEHP組影響則不顯著。表2還顯示, 在DEHP實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi),其紅細(xì)胞核異常率和總核異常率與水對(duì)照組相比均極顯著升高(P＜0.01), 與吐溫–80組相比, 除5 mg/L組顯著升高外, 其他較高濃度的DEHP組也均極顯著升高。這說(shuō)明, 較高濃度的 DEHP對(duì)鯉具有較強(qiáng)的遺傳毒性, 其中吐溫–80 也可能具有一定的協(xié)同作用。

圖3 DEHP對(duì)鯉血清補(bǔ)體C3含量的影響Fig. 3 Effect of DEHP on content of complement C3in serum of carps

圖 4 DEHP對(duì)鯉血清補(bǔ)體C4含量的影響Fig. 4 Effect of DEHP on content of complement C4in serum of carps

DEHP致鯉肝臟細(xì)胞DPC交聯(lián)系數(shù)的影響圖 5為小牛胸腺 DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線, y=0.1342x+ 48.803(R2=0.9958)。圖6顯示, 吐溫–80組與水對(duì)照組相比, DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)系數(shù)雖略有上升, 但差異不顯著。在 DEHP實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi), 與水對(duì)照組和吐溫–80組相比, DEHP均能極顯著提高DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)系數(shù), 即 DEHP能顯著誘導(dǎo) DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)。

3 討論

表2 DEHP對(duì)鯉紅細(xì)胞微核率及核異常率的影響Tab. 2 Effect of DEHP on micronucleus and nuclear abnormality of erythrocytes in carps

圖 5 DNA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve of DNA concentration

圖 6 DEHP 對(duì)鯉肝臟細(xì)胞DPC的效應(yīng)Fig. 6 DPC formation in hepatocyte of carps induced by DEHP

魚(yú)類屬于較低等的脊椎動(dòng)物, 其特異性免疫機(jī)質(zhì)還很不完善, 因此, 非特異性免疫在魚(yú)類的免疫防御中發(fā)揮著重要作用[10]。在機(jī)體免疫防御中, 白細(xì)胞能吞噬進(jìn)入機(jī)體的異物, 在非特異性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[11,12]。血清中補(bǔ)體、溶菌酶、干擾素等也是構(gòu)成非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分,能抵抗外來(lái)病原菌的入侵, 具有抗菌殺菌能力, 反應(yīng)了機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答能力[13]。溶菌酶是一種堿性蛋白, 廣泛存在于魚(yú)的體表黏液、血清及巨噬細(xì)胞中, 能破壞和消除入侵體內(nèi)的異物, 其活性會(huì)因外界環(huán)境因子的影響而表現(xiàn)為應(yīng)激或抑制[14], 一定程度上反映了病原菌及環(huán)境因素對(duì)魚(yú)體健康狀況的影響[15,16]。 本研究結(jié)果表明, 在DEHP對(duì)鯉染毒20d時(shí), 與吐溫–80組相比, 80、160 mg/L DEHP 組均能顯著降低鯉白細(xì)胞的吞噬活力、吞噬指數(shù)及溶菌酶活性, 而5、20 mg/L DEHP 組則影響不顯著。較高濃度的DEHP能通過(guò)降低白細(xì)胞的吞噬能力、血清溶菌酶活性而降低魚(yú)類的非特異性免疫功能。這和李蕾等[17]報(bào)道的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)能顯著降低小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力相一致, 其研究還表明, DBP降低巨噬細(xì)胞的吞噬能力是因?yàn)镈BP顯著降低了巨噬細(xì)胞清道夫受體CD36的表達(dá)所致。DEHP是DBP的同系物, 其降低白細(xì)胞的吞噬能力的機(jī)理可能和DBP的作用機(jī)理一致。溶菌酶來(lái)自于單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞, 較高劑量的DEHP能致溶菌酶活性降低, 也許是因?yàn)? DEHP對(duì)機(jī)體有損傷作用,隨DEHP劑量的增高, 細(xì)胞受到破壞, 溶菌酶分泌不足, 或結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 導(dǎo)致溶菌酶活性降低, 其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

補(bǔ)體是非特異性免疫系統(tǒng)中的重要組成部分,具有中和毒素、清除病菌等重要生物學(xué)功能[18], 其中補(bǔ)體C3含量最高, 在補(bǔ)體激活旁路中起關(guān)鍵作用, 補(bǔ)體C4是參與經(jīng)典途徑和凝集素途徑活化的重要因子, 血清補(bǔ)體C3、C4含量水平在一定程度上反映了機(jī)體免疫病理性損傷狀況[19]。一般來(lái)說(shuō), 機(jī)體內(nèi)補(bǔ)體分子約90%是由肝臟產(chǎn)生, 在正常生理狀態(tài)下, 其C3、C4濃度保持相對(duì)穩(wěn)定, 若其含量降低,主要有兩個(gè)原因: 合成減少和消耗增加[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在DEHP實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi), C4含量, 5、20、80 mg/L組補(bǔ)體C3含量與吐溫–80組相比差異均不顯著, 但160 mg/L組補(bǔ)體C3含量卻顯著降低。這可能是因?yàn)? DEHP雖能引起C3、C4的大量消耗, 但肝臟產(chǎn)生補(bǔ)體的功能強(qiáng)大, 消耗的補(bǔ)體得以補(bǔ)償, 所以差異不顯著。但DEHP濃度較高時(shí), 肝臟可能受到了損傷[21], 產(chǎn)生補(bǔ)體的能力減弱, 所以C3含量顯著降低, 其機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。抗菌活力是細(xì)胞和體液免疫的綜合體現(xiàn), 反映了機(jī)體對(duì)病原微生物侵染的防御能力[22]。本實(shí)驗(yàn)表明, 較高濃度的DEHP(80、160 mg/L)組血清抗菌活力顯著降低, 這可能與血清溶菌酶活力、補(bǔ)體含量降低等密切相關(guān)。

微核是除主核之外, 存在于胞質(zhì)中獨(dú)立的微小核物質(zhì), 是細(xì)胞分裂后期, 帶著絲粒染色體向紡錘體兩極移動(dòng)時(shí), 無(wú)著絲點(diǎn)的染色體和染色體斷片落后而形成[23]。微核率是有毒物質(zhì)(如重金屬離子、農(nóng)藥等)對(duì)細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷的重要指標(biāo), 可用來(lái)評(píng)價(jià)水域污染物對(duì)魚(yú)類的遺傳毒性效應(yīng)[24]。本實(shí)驗(yàn)表明,較高濃度的DEHP(160 mg/L)能顯著誘導(dǎo)紅細(xì)胞微核的產(chǎn)生, 且在DEHP實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi), 顯著提高了核異常率和總核異常率, 這和王蕊等[25]報(bào)道的DEHP能顯著提高小鼠紅細(xì)胞微核率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這說(shuō)明一定濃度的DEHP可能會(huì)對(duì)染色體或紡錘絲的形成有毒害作用。

DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度也是檢測(cè)有毒物質(zhì)是否具有遺傳毒性的重要指標(biāo)。一般認(rèn)為, DNA和蛋白質(zhì)一定程度的交聯(lián), 對(duì)維持細(xì)胞的正常活動(dòng)是非常必要的, 如DNA和組蛋白的結(jié)合, 但是過(guò)量的DPC會(huì)引起DNA的構(gòu)象和功能產(chǎn)生變化, 導(dǎo)致DNA損傷, 染色體斷裂、基因突變, 從而導(dǎo)致嚴(yán)重的遺傳毒性。此外, 它與癌癥的發(fā)生也密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在DEHP實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi), DEHP均能極顯著誘導(dǎo)DNA和蛋白質(zhì)的交聯(lián)。這說(shuō)明DEHP具有較強(qiáng)的遺傳毒性, 這與DEHP能誘導(dǎo)赤子愛(ài)勝蚓體細(xì)胞[26]和小鼠肝細(xì)胞[27]DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。原因可能是DEHP在機(jī)體內(nèi)降解能產(chǎn)生大量的羥自由基的結(jié)果, 羥自由基是誘發(fā)DPC的重要因素。微核實(shí)驗(yàn)和DPC交聯(lián)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果, 說(shuō)明DEHP具有較強(qiáng)的遺傳毒性。較低劑量的DEHP能引起DPC交聯(lián), 但不能顯著提高微核率; 較高劑量的DEHP才誘導(dǎo)了微核率的顯著升高, 說(shuō)明DPC的交聯(lián)發(fā)生在微核形成之前, 也說(shuō)明DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)更能靈敏的反映毒物的遺傳毒性。

在本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中, 20 mg/L DEHP組白細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)、20、80 mg/L DEHP組補(bǔ)體C3含量, 160 mg/L組補(bǔ)體C4含量, 與吐溫–80組相比差異不顯著, 但均顯著低于水對(duì)照組。160 mg/L 組補(bǔ)體C3含量顯著低于吐溫–80組, 卻極顯著低于水對(duì)照組。80 mg/L DEHP組紅細(xì)胞微核率顯著高于水對(duì)照組, 但與吐溫–80組相比差異不顯著, 吐溫–80組總核異常率顯著高于水對(duì)照組。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示,吐溫–80對(duì)鯉也可能具有一定的免疫毒性和遺傳毒性, 而且在DEHP對(duì)鯉具有免疫和遺傳毒性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中, 吐溫–80也可能起到了一定的協(xié)同作用。吐溫–80作為助溶劑對(duì)DEHP的致毒效應(yīng)是否具有協(xié)同作用還有待進(jìn)一步深入研究。

致謝:

實(shí)驗(yàn)期間, 菏澤學(xué)院生命科學(xué)系吳紅松老師,朱道玉教授, 周長(zhǎng)路、張紅梅副教授給予了大量幫助, 謹(jǐn)致謝意。

[1] Chen L, Jiang L, Chen H S, et al. Influence of dibutyl phthalate on development of hippocampus nervous cells of rat's offspring [J]. Chinese Journal of Industrial Hygiene and Occupational Diseases, 2010, 28(7): 530—533 [陳龍, 蔣莉,陳恒勝, 等. 鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)子代大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的影響. 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2010, 28(7): 530—533]

[2] Faber W D, Deyo J A, Stump D G, et al. Developmental toxicity and uterotrophic studies with di-2-ethylhexyl terephthalate [J]. Birth Defects Research part BDevelopmental and Reproductive Toxicology, 2007, 80(5): 396—405

[3] Liu D Y, Wu S D, Hua Y, et al. Effect of di-2-(ethylhexy1) phthalate induced cryptorchidism on apoptosis of germ cells in infant SD rats [J]. Chinese Journal of Biologicals, 2013, 26(3): 368—371 [劉東堯, 吳盛德, 燚華 , 等. 鄰苯二甲酸二(2-乙基) 己酯誘導(dǎo)隱睪對(duì) SD 幼鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡的影響. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志, 2013, 26(3): 368—371]

[4] Hayashi Y, Ito Y, Nakajima T. Relationship of maternal malnutrition caused by Di (2-ethylhexyl)phthalate exposure with lifestyle disease in offspring [J]. Nihon Eiseigaku Zasshi, 2012, 67(1): 22—25

[5] Qiao Y K, Wang K, Yan Y, et al. Effect of toxicity and asthma on di-(2-Ethythexyl) phthalate [J]. Chinese Journal of Public Health Engineering, 2006, 5(4): 236—238 [喬永康,王昆, 嚴(yán)彥, 等. 鄰苯二甲酸二異辛酯的毒性和致哮喘作用. 中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué), 2006, 5(4): 236—238]

[6] Li M M, Yu Z B, Han S P, et al. Oxic effect of di (2-ethylhexyl)-phthalate on zebrafish heart development [J]. Journal of Applied Clinical Pediatrics, 2013, 28(1): 48—51[李萌萌, 余章斌, 韓樹(shù)萍, 等. 鄰苯二甲酸二乙基己酯對(duì)斑馬魚(yú)胚胎心臟發(fā)育的毒性. 中華實(shí)用兒科臨床雜志, 2013, 28(1): 48—51]

[7] Wang Y Y, Sun H S, Li G Y. The Effects of immuno drugson antibacterial and bacteriolytic activities in the haemolymph of Penaeus chinensis [J]. Advances in Marine Cience, 2004, 22(1): 69—72 [王宜艷, 孫虎山, 李光友. 復(fù)合免疫藥物對(duì)中國(guó)對(duì)蝦血淋巴抗菌溶菌活力的影響. 海洋科學(xué)進(jìn)展, 2004, 22(1): 69—72]

[8] Xu Q, Yang X, Yang G T, et al. Study on DNA damage of the kidney cells of mice induced by formaldehyde at different doses [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2007, 27(2): 276—281 [徐錢(qián), 楊旭, 楊光濤, 等. 不同濃度甲醛致小鼠腎細(xì)胞DNA損傷效應(yīng)研究. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2007, 27(2): 276—281]

[9] Pan L Q, Liu N, Wang J. Study of biomarkers selection of the scallop Chlamys farreri exposed to exposed to B[a]P [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(2): 299—306 [潘魯青,劉娜, 王靜. 櫛孔扇貝在B[a]P脅迫下生物標(biāo)志物篩選的研究. 水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(2): 299—306]

[10] Ellis A E．Immunity to bacteria in fish [J]．Fish ＆ Shellfish Immunology, 1999, 9(4): 291—308

[11] Wang K Y, Huang J L, Xiao D, et al. The immunoprotection of Stenotrophomonas maltophilia lipopolysaccharide in channel catfish [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(3): 433—440 [汪開(kāi)毓, 黃錦爐, 肖丹, 等. 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌脂多糖對(duì)斑點(diǎn)叉尾 免疫保護(hù)作用. 水生生物學(xué)報(bào), 2012, 36(3): 433—440]

[12] Yan Q P, Zhang J J, Zou W Z, et al. Effect of experimental infection with Vibrio alginolyticus on immune parameters of Pseudosciaena crocea [J]. Journal of Fisheries of China, 2007, 31(2): 250—256 [鄢慶枇, 張俊杰, 鄒文政, 等. 人工感染溶藻弧菌對(duì)大黃魚(yú)免疫功能的影響.水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2007, 31(2): 250—256]

[13] Tonk E C, Verhoef A, Gremmer E R, et al．Relative sensitivity of developmental and immune parameters in juvenile versus adult male rats after exposure to di(2-ethylhexyl)phthalate [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2012, 260(1): 48—57

[14] Chen J Z, Zang X L, Meng S L, et al. Effect of nitrite nitrogen stress on the activities of nonspecific immune enzymes in serum of tilapia (GIFT Oreochromis niloticus) [J]. Ecology and Environment Sciences, 2012, 21(5): 897—901 [陳家長(zhǎng), 臧學(xué)磊, 孟順龍, 等. 亞硝酸鹽氮脅迫對(duì)羅非魚(yú)(GIFT Oreochromis niloticus) 血清非特異性免疫酶活性的影響. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2012, 21(5): 897—901]

[15] Han Y, Zhang H, Wang K. Activity of SOD and GSH-Px in the blood of fingerling Cyprinus carpio under different nitrite concentration [J]. Freshwater Fisheries, 2007, 37(1): 66—68 [韓英, 張輝, 王琨. 亞硝態(tài)氮對(duì)鯉魚(yú)種血液 SOD及GSH-Px的影響. 淡水漁業(yè), 2007, 37(1): 66—68]

[16] Wang S R. Modern Animal Immunology [M]. Changchun: Jilin science and Technology Press. 1996, 116—117 [王世若.現(xiàn)代動(dòng)物免疫學(xué). 長(zhǎng)春: 吉林科學(xué)技術(shù)出版社. 1996, 116—117]

[17] Li L, Li H S, Song N N, et al. Studies on the effect of dibutyl phthalate on the phagocytosis of macrophages [J]. Chinese Journal of Immunology , 2011, 27(9): 771—778 [李蕾, 李海山, 宋乃寧, 等. 鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響研究. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2011, 27(9): 771—778]

[18] Wang Z P, Zhang S C, Wang G F. Advances on the complement components, characteristic and function of complement system in fish [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2008, 32(5): 760—769 [王志平, 張士璀, 王光鋒. 魚(yú)類補(bǔ)體系統(tǒng)成分及補(bǔ)體特異性和功能的研究進(jìn)展. 水生生物學(xué)報(bào), 2008, 32(5): 760—769]

[19] Wang J Y, Fan H M, Liu Z M, et al. The clinical value of dynamic determination of serum complement C3and complement C4during perioperation of cardiopulmonary bypass surgery [J]. Journal of Tongji University (Medical Science), 2006, 27(4): 21—23 [汪進(jìn)益, 范慧敏, 劉中民,等. 體外循環(huán)圍術(shù)期患者血清補(bǔ)體C3, C4水平變化及臨床意義. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2006, 27(4): 21—23]

[20] Zhu Q X, Xu H, Leng J, et al. Changes in humoral immunity in sensitized guinea pigs exposed to trichloroethylene [J]. Chinese Journal of Industrial Hygiene and Occupational Diseases, 2012, 30(9): 641—644 [朱啟星, 徐輝, 冷靜, 等.三氯乙烯致敏豚鼠體液免疫變化. 中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 2012, 30(9): 641—644]

[21] Li S G, Zhao W H, Jin T Y. Effects of Di-2-ethylhexylphalate on viscera in mice [J]. Chinese Journal of Public Health, 2006, 22(5): 589—591[厲曙光, 趙文紅, 金泰 . 鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯對(duì)小鼠臟器損傷作用.中國(guó)公共衛(wèi)生, 2006, 22(5): 589—591]廙

[22] Yang J Y, Guo L Y, Chen F S, et al. The effects of lipopolysaccharides from two strains of oligotrophic bacteria from antarctic ocean Alteromonas stellipolaris on non-specific immunity of the swimming crab Portunus trituberculatus [J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2011, 42(2): 294—299 [楊季芳, 郭盧云, 陳福生, 等. 2株南極海洋寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌(Alteromonas stellipolaris)脂多糖對(duì)三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)非特異性免疫活性的影響.海洋與湖沼, 2011, 42(2): 294—299]

[23] Zhang G S, Zhu D Y. Study on micronuclei and nuclear abnormalities induced by Cu2+in Hemiculter leucisculus erythrocytes [J]. Journal of environment and Health, 2006, 23(6): 543—545 [張貴生, 朱道玉. 銅離子誘發(fā) 鰷魚(yú)紅細(xì)胞微核及核異常的研究. 環(huán)境與健康雜志, 2006, 23(6): 543—545]

[24] Ye J D, Han Y W, Yang Y H, et al. Effect of olaquindox on oxygen consumption, red blood cell number, hematocrit and dyskaryosis in erythrocytes in mirror carp Cyprinus carpio L. [J]. Journal of Dalian Fisheries University, 2003, 18(1): 14—18 [葉繼丹, 韓友文, 楊雨輝, 等. 喹乙醇對(duì)鯉耗氧率、紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞比積及紅細(xì)胞微核率的影響. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 18(1): 14—18]

[25] Wang R, Li H Q, Guo Q M, et al. Study on the mutagenicityand teratogenicity of DEHP [J]. Carcinogenesis, Teratogenesis and Mutagenesis, 2002, 14(2): 120—121 [王蕊, 李厚勇, 郭啟明, 等. 鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯致畸致突變實(shí)驗(yàn)研究. 癌變·畸變·突變, 2002, 14(2): 120—121]

[26] Zeng Q, Cheng W W, Cai F Y, et al. Oxidation Damage

Induced by Di-(2-ethylhexyl)phthlate on the cells of Esisenia foelide [J]. Asian Journal of Ecotoxicolog, 2010, 5(5): 718—723 [曾強(qiáng), 程文文, 蔡鳳云, 等. 鄰苯二甲酸二異辛酯致赤子愛(ài)勝蚓體細(xì)胞氧化損傷的研究. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2010, 5(5): 718—723]

[27] Wu K, Wang L M, Liu D D, et al. Study on DNA-protein crosslinks of mice liver induced by di-(2-ethylhexyl) phthalate [J]. Journal of Medical Research, 2006, 35(11): 13—16 [吳凱, 王黎明, 劉丹丹, 等. 鄰苯二甲酸二異辛酯致小鼠肝DNA蛋白質(zhì)交聯(lián)效應(yīng)研究. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2006, 35(11): 13—16]

EFFECT OF DEHP ON NON-SPECIFIC IMMUNE FUNCTION AND GENETIC TOXICITY OF CYPRINUS CARPIO LINNAEUS

ZHANG Gui-Sheng
(Department of Life Sciences, Heze University, Heze 274015, China)

To study the effect of DEHP [Di-(2-ethylhexyl) phthalate] on the nonspecific immune function and genetic toxicity in Cyprinus carpio, four experimental concentrations of 5, 20, 80 and 160 mg/L of DEHP were treated to the C. Carpio for 20 days, H2O and Tween–80 were used as the controls respectively. The results showed that, when compared with the two controls, all indexes showed no significantly difference except the total nuclear abnormal rate in erythrocytes which significantly increased in the Tween–80 group. Phagocytic activity and index (PI) of leucocytes, antibacterial activity and lysozyme activity of serum in the 80, 160 mg/L of DEHP groups were significantly lower than those in the two controls, and also phagocytic activity and index (PI) of leucocytes in 20 mg/L group decreased remarkably (P＜0.05 or P＜0.01) when compared with the water control group. When compared with the tween–80 group, the C3content in serum of the 160 mg/L group decreased significantly. However, the C3content in the groups of 5, 20 and 80 mg/L, and the C4content in the groups of 5, 20, 80 and 160 mg/L showed no significantly differences. When compared with the water control group, the C3content in the groups of 20, 80 and 160 mg/L, and the C4content in the group of 160 mg/L decreased remarkably (P＜0.05 or P＜0.01). Micronuclei rate of erythrocytes in the group of 160 mg/L was significantly higher than that in the group of tween–80, and micronuclei rate of erythrocytes in the group of 80 and 160 mg/L was significantly higher than that in the water control group. In the range of the DEHP concentration, the rate of nuclear abnormalities and total nuclear abnormalities of erythrocytes and the DPC coefficient of hepatocyte all increased significantly when compared with the two control groups. The immune and genetic toxicity on carp can be caused by a certain concentration of DEHP.

Di-(2-ethylhexyl)phthalate(DEHP); Cyprinus carpio Linnaeus; Leucocyte; Lysozyme; Antibacterial activity; Complement; Micronucleus; DNA-protein cross-link

X171.5

A

1000-3207(2014)04-0729-08

10.7541/2014.103

2013-11-12;

2014-03-26

山東省自然科學(xué)基金(ZR2010CM046); 山東省動(dòng)物生理生化與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(2011.06)資助

張貴生(1972—), 男, 山東定陶縣人; 副教授, 碩士; 研究方向?yàn)轸~(yú)類生態(tài)毒理學(xué)。E-mail: zgz2007hzxy@126.com