激光粒度儀測定浮游植物粒徑的可行性研究

劉冬燕古濱河高 俊柳云龍

(1. 上海師范大學環境科學系, 上海 200234; 2. 上海師范大學城市生態與環境研究中心, 上海 200234; 3. 暨南大學生態學系, 廣州510063)

激光粒度儀測定浮游植物粒徑的可行性研究

劉冬燕1,2古濱河3高 俊2柳云龍2

(1. 上海師范大學環境科學系, 上海 200234; 2. 上海師范大學城市生態與環境研究中心, 上海 200234; 3. 暨南大學生態學系, 廣州510063)

不同粒級大小的浮游植物有著不同的生態學意義,粒度基本上反映了從低營養級到高營養級間的生物量、能量等各種關系。生態系統中的能流分配, 在很大程度上取決于生物顆粒的大小, 以粒徑大小作為標準能夠簡化食物網, 克服浮游植物在物種分類上的局限, 使浮游植物群落乃至浮游生態系統的研究擺脫物種間復雜相互關系的阻拌, 能促進浮游生態系統的物質與能量研究[1]。

浮游植物的粒徑測量方法有多種, 如顯微測微計法、葉綠素分級法、庫爾特計數法、流式細胞儀法和激光粒度分析法等[2]。顯微測微計法是測量浮游植物粒徑的經典和基準方法[3], 具有直觀的優點, 但其工作量大, 耗時多,不能形成連續的粒徑譜, 也不適用于浮游生物的現場檢測; 葉綠素分級法, 以下簡稱分級法, 是浮游生物粒徑研究最常用的方法之一, 此法需要萃取葉綠素, 檢測速度慢, 所得粒徑只有有限的幾個等級, 得到的結果較粗略和籠統[4]; 庫爾特計數法可直接測量顆粒物體積及其分布, 但其粒徑測量范圍一般為1—120 μm, 測量結果可能偏低[5,6]; 流式細胞法可以檢測以浮游植物為主的含有葉綠素的顆粒, 分選出不同的生態類群, 是研究浮游植物群落結構的一種重要手段[7—9], 但目前一般流式細胞儀的最佳檢測范圍是 0.5—20 μm, 對于較大的顆粒難以操作, 不同種類浮游植物所需不同染色劑之間相互干擾,前處理中會損失部分細胞, 易受外界干擾, 很難進行船載現場檢測。

隨著科技的發展, 粒徑自動化測量將是粒徑研究的趨勢之一, 浮游植物粒徑分析的新技術有HPLC 技術、熒光顯微技術、流式細胞技術、聲學測量技術、圖像分析技術以及光學測量技術等[5,6,10—12]。但這些技術大多都還處于探索階段, 在測定粒徑組成時需要確定各種方法的可行性和精準性。

如上所述, 測量浮游植物粒徑的方法有多種,但這些方法不是步驟繁瑣, 就是受人為因素影響大, 或者測定的范圍有限, 難以進行現場檢測, 或者技術不成熟, 尚處于探索階段。激光粒度分析法(以下簡稱激光法)克服了傳統測量方法的局限性, 具有測量速度快、動態范圍大、操作簡便、重復性好、準確度高等優點, 能給出詳細的粒度分布情況, 但它不能區分生物顆粒和非生物顆粒[13]。因此,能否用激光粒度技術來測定浮游植物粒徑分布還處于探索階段, 本文利用葉綠素分級法與激光粒度分析法分別測定浮游植物粒徑, 對比兩種方法間的差異與相關度,以探討激光法測定浮游植物粒徑的可行性。

1 材料與方法

于2012年在上海師范大學環境科學與工程系調節池中采4個平行水樣, 每次約90 L, 每隔4天采一次, 用激光粒度儀和分級法分別進行浮游植物粒徑測定。

1.1 激光粒度法

先對藻類進行固定: 取2000 mL水樣用200 μm分樣篩過濾, 以去除大型浮游動物活動對浮游植物的影響;濾液置于燒杯中, 加入30 mL魯哥氏液并搖勻, 靜置24h,用虹吸管吸去部分上清液, 轉入500 mL的分液漏斗中靜置 24h, 用虹吸管吸去上清液, 將下層沉淀混合液移入具塞試管中備用。

測定前手動搖勻備用水樣, 以將原始樣品分散成單顆粒。設置數據輸出為0.2—2、2—20、20—200 μm三檔, 用Beckman Coulter的LS13320型臺式激光粒度分析儀測定, 并測量其中位數與平均值。

1.2 葉綠素分級法

本文按照國際通用標準將浮游植物分為網采浮游植物(Netphytoplankton, 20—200 μm, 以下記NET-); 微型浮游植物(Nanophytoplankton, 2—20 μm, 以下記NANO-); 微微型浮游植物(Picophytoplankton, 0.2—2 μm, 以下記PICO-)。

取3000 mL左右的水樣, 用200 μm分樣篩過濾, 以去除大型浮游動物活動對浮游植物的影響。在實驗室進行分級, 用20 μm分樣篩過濾, 所得水樣再用2 μm混合纖維濾膜抽濾, 得＜200 μm、＜20 μm、＜2 μm的水樣。各分級水樣分別經濾紙(Whatman GF/C)過濾, 用分光光度法分別測定各粒級的葉綠素 a含量[14], 以差減法得 20—200、2—20、0.2—2 μm三個粒級的浮游植物葉綠素a含量, 利用百分比法計算得各粒級的百分比。

2 結果

2.1 激光法和分級法所測得 NET、NANO、PICO粒級百分比均值及標準誤

從圖1可見, 分級法與激光粒度法測得的NET粒級百分比均值在2月14日、2月24日以及4月4日有差異,其他時間結果較一致; NANO粒級百分比均值在3月5日和3月20日有所差距,其他時間結果較一致; 而對于PICO粒級百分比均值, 激光粒度法所測得的普遍要比用分級法所測的結果高, 除了2月14日和3月20日比較一致外,其他時間結果不一致。

2.2 激光粒度法實驗數據的重復性

利用激光粒度儀對同一樣品進行 10次測試, 測定其PICO粒級、NANO粒級以及NET粒級的百分比及其平均粒徑和中位粒徑, 并分別進行方差分析, 各值的P值均大于0.05 (表1), 一般情況下, P＜0.01為非常顯著, 0.01＜P＜0.05為顯著, P＞0.05為無差異, 激光粒度儀所測各值均顯示為無差異, 表明激光粒度儀在測量樣品時的重復性好。

表1 激光粒度法所測各參數的方差分析Tab.1 Analysis of variance about each Parameter of Lazer Particle Size Analyzer

2.3 激光粒度法的其他測量結果

據圖 2左所示, 激光粒度法在實驗初期(2月 5日至2月24日)所測得的平均粒徑值較小, 最小值僅3.61 μm, 3月份后平均粒徑值處在一個較高的水平上, 最高值達66.25 μm。中位粒徑的走勢和平均粒徑基本一致。

3 討論

3.1 激光粒度儀測定浮游植物粒徑的可行性

利用配對 T檢驗對分級法和激光法所測結果進行差異性檢驗, 統計分析表明, 兩種方法所測得的 NET和NANO粒級沒有顯著差異(P＞0.05), 而PICO粒級有顯著差異(P＜0.05)(表2)。

利用相關分析對分級法和激光法進行相關性檢驗,結果表明, 兩種方法所得NET和NANO粒級百分比有極顯著相關(P＜0.01), 相關系數分別為0.533和0.543 (表2),說明兩種粒徑測定方法對NET和NANO粒級的測定結果擬合度非常好。而兩種方法所得PICO粒級沒有顯著相關(P＞0.05), 相關系數為–0.036, 說明兩種粒徑測定方法對PICO粒級的測定結果擬合度并不好。

如上可見, 對于NET和NANO粒級, 兩種粒度法所測結果吻合度較好; 對于PICO粒級而言, 兩種粒度法所測PICO粒級的結果吻合度不好。另外, 激光法所測PICO粒級百分比要比分級法測得的值高(圖 1), 這可能是由于激光粒度法測定水樣中不僅包括浮游植物, 還包括細菌、有機顆粒與無機物顆粒等物質, 而這些物質主要集中在0.2—2 μm的范圍, 因此激光法測得的PICO粒級百分比偏高。而分級法是采用濾紙過濾水樣, 濾紙有一定的孔徑,這樣會遺漏掉一些小于濾紙孔徑的微微型浮游植物, 另外, 分級法在研磨與樣品轉移等過程中也會人為損失一部分葉綠素, 因此, 用分級法測得的結果會偏小一些。兩種粒徑測定方法一個結果偏低, 一個結果偏高, 所得結果相關性不顯著也就可以理解, 因此, 無論是用激光粒度法還是用葉綠素分級法測定浮游植物 PICO粒級百分比時均需要謹慎。

圖 1 激光法和分級法所測NET、NANO、PICO粒級百分比均值及標準差Fig. 1 The Mean and Standard Deviation of NET, NANO and PICO size percentage by methods of Size-fractionated and Lazer Particle Size Analyzer

圖2 激光法所測中位粒徑和平均粒徑Fig. 2 The Median Size and Mean Size on methods of Lazer Particle Size Analyzer

3.2 激光粒度法和葉綠素分級法的比較

葉綠素分級法 利用葉綠素分級法測定浮游植物粒徑已得較普遍的應用[14—16], 分級法最大的優勢是不受水體其他懸浮顆粒物如有機碎屑與無機顆粒等的干擾,不僅能得到所選浮游植物粒徑的百分比值, 還能給出此粒徑浮游植物的葉綠素(生物量)含量, 測定結果能代表不同粒徑的浮游植物。但是, 分級法不能連續測定浮游植物的粒級, 只能測定一定粒徑等級的浮游植物。這是因為當所需測定的粒徑等級多時, 所需水樣量會大大增加, 尤其是微微型浮游植物, 由于數量少, 需要抽濾的水量多。如此一來, 水樣的搬運會十分吃力, 水樣抽濾也會耗費較多的時間, 野外工作量及時間都會受到限制。因此, 對每個水樣進行3次統計學意義上的重復性測試很少在研究中見到, 這也是為何葉綠素分級法一般只做3個等級的粒級測定的原因。其次, 分級法在實驗過程中步驟復雜, 樣品在不同容器間轉移次數多, 易造成葉綠素損失, 實驗結果偏低。目前看來, 多數研究一般每個水樣只做一次,但測定時會重復測2—3次, 然而, 如前所述, 樣品只做一次容易發生傾倒或其他環節失誤而導致誤差增加。

表2 分級法和激光法測得各粒級百分比的配對T檢驗與相關分析Tab. 2 Paired Samples T test and Correlation analysis of Size-fractionated and Lazer Particle Size Analyzer of all size percentage

激光粒度法 激光粒度分析方法是近年來發展較快的一種測試方法, 其測量的粒徑范圍廣, 測試速度快,操作簡便, 減少了樣品的損失, 降低了標準偏差, 且具有受人為因素影響小, 測定結果重復性好等優點(表1), 能獲得所測水樣顆粒物的平均粒徑與中位粒徑(圖2), 可以連續測量任意粒級的浮游植物百分比, 獲得多等級以及連續的粒徑分布。激光粒度法在測定浮游植物較大的粒徑時, 具有相當強的可信度和精確度, 然而在低粒徑區域容易受到無機物顆粒的干擾, 實驗結果會偏高。另外, 激光粒度法只能測量顆粒的百分含量, 無法解釋水體浮游植物的生物量狀況。因此, 就本研究所得結果看, 如果僅僅需要測量水樣中較大粒級浮游植物的百分比含量, 則激光粒度法不失為一種非常好的選擇。如果需要測定小顆粒百分比或浮游植物粒級生物量, 則需要配合其他的方法共同完成。

4 結語

從本研究結果看, 利用激光粒度法來測定浮游植物的NET和NANO粒級百分比是可行的。但是, 對于PICO粒級百分比而言, 利用激光粒度法測定所得結果偏高,而用分級法測得的結果則偏小一些。因此, 無論用激光粒度法還是用葉綠素分級法測定浮游植物 PICO粒級時均需要謹慎。

隨著科技的發展, 粒徑自動化測量將是粒徑研究的趨勢之一, 利用激光粒度技術在進行浮游植物粒徑研究時可以結合各種顆粒分類技術, 同時應用粒徑方法與分類方法, 以得到浮游植物的顆粒結構。此外, 如果需要了解水體中浮游植物粒徑生物量的分布, 則需要將激光粒度自動化技術與葉綠素分級法相結合, 由此可見, 雖然傳統的粒徑分析方法具有耗時、繁瑣的缺點, 但是對研究具體粒徑范圍的信息是有意義的。因此, 應該重視粒徑方法與傳統分類方法的結合。需要注意的是, 激光粒度分析中忽略了非生物顆粒物的影響。使用多種技術獲得的粒徑數據放在一起分析時需要考慮數據整合問題, 不能簡單的等同或者替代, 應該重視新的粒徑測量手段應用可能帶來的不利影響。關于如何建立非生物顆粒物影響的評估和校正方法問題, 尚需尋找其他的粒徑分級方法以進行進一步研究。

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A FEASIBILITY STUDY ON MEASURING PHYTOPLANKTON SIZE BY LASER PARTICLE SIZE ANALYZER

LIU Dong-Yan1,2, GU Bin-He3, GAO Jun2and LIU Yun-Long2
(1. Department of Environmental Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 2. Urban Ecology and Environment Research Centre, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China; 3. Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510063, China)

激光粒度法; 葉綠素分級法; 浮游植物; 粒級

Laser particle size analyzer; Size-fractionated Chlorophyll-a; Phytoplankton; Size fraction

Q178.1

A

1000-3207(2014)06-1185-05

10.7541/2014.172

2013-11-12;

2014-05-11

國家自然科學基金(31170441; 31070419); 上海師范大學原創與前瞻性預研項目(DYL201304); 上海地方院校“十二五”內涵建設項目; 國家環境保護局水專項之分項資助

劉冬燕(1969—), 女, 湖北監利人; 博士; 主要從事浮游生物生態學方面的研究。E-mail: liudy@shnu.edu.cn

柳云龍, E-mail: liu_zju@126.com