鯽Dmrt3基因的克隆和表達分析

王 佳 羅 琛

(浙江大學生命科學學院, 杭州 310058)

鯽Dmrt3基因的克隆和表達分析

王 佳 羅 琛

(浙江大學生命科學學院, 杭州 310058)

DMRT家族是一個與性別決定相關的轉錄因子家族。為了研究家族成員之一的Dmrt3在我國重要養殖魚類鯽胚胎發育、性別分化中的功能以及在育種中的作用, 我們克隆了鯽 Dmrt3基因的 cDNA全長, 并對Dmrt3基因在發育早期和不同組織中的表達進行了分析。結果顯示: 鯽Dmrt3基因cDNA全長為2182 bp, 其中5′端非編碼區408 bp, 3′端非編碼區427 bp, 開放閱讀框1347 bp, 編碼448個氨基酸。蛋白結構預測顯示DMRT3除了正常的DM結構域外, 還有DMA結構域, 在進化上與DMRT4和DMRT5的親緣關系更近。巢式RT-PCR分析結果表明Dmrt3直到尾芽期才開始有微量表達, 表達量在15體節期有明顯增加但仍然處在一個較低的水平; 在成體組織中只在精巢中檢測到表達。這種表達時空模式提示Dmrt3可能在早期器官發生和雄性性腺發育調控中起作用。對Dmrt3啟動子CpG島的甲基化分析表明所檢測的組織和配子中并不發生甲基化, 說明這種雌雄特異性和組織特異性差異表達并不是通過對該基因啟動子的差異甲基化修飾來調控的。此外, 我們還發現了鯽 Dmrt3的一個由逆轉錄產物形成的假基因 pDmrt3。這些結果為進一步研究鯽Dmrt3在性別分化中的作用和評估其在鯽性別控制育種中的價值, 以及分析 DMRT家族的進化關系提供了基礎資料。

鯽; Dmrt3; 基因克隆; 基因表達

DMRT(Doublesex and Mab-3 related transcription factor)家族是一個與性別決定相關的轉錄因子家族。該家族成員編碼的蛋白質都具有一個富含半胱氨酸的 DNA結合結構域(DNA-binding motif, DM)[1]。該結構域為螯合兩個Zn原子的鋅指結構[2,3],在不同的脊椎動物之間存在著高度的保守性[4]。但不同的 Dmrt家族基因在表達上存在差異并在功能上出現了明顯的分化。在小鼠中, Dmrt1于性別決定早期在生殖嵴中表達, Dmrt1缺失的小鼠精巢分化受到嚴重的影響[5]。在已檢測過的魚類中 Dmrt1也只在性腺中表達, 在其他組織中幾乎不表達, 而且在雄性性腺中表達量顯著高于雌性, 表明該基因在性別決定和性腺發育中具有重要作用[6—10]。在斜帶石斑魚中的研究表明Dmrt1只在精巢的生精細胞中表達而不在支持細胞中表達, 提示其可能的功能是調控精原細胞向精母細胞發育[11]。 鳉在青 胚胎發育期, Dmrt2主要在體節中胚層中表達[12]。在斑馬魚中, Dmrt2有兩個在基因加倍后形成的不同拷貝Dmrt2a和Dmrt2b[13], 二者也主要在前體節中胚層和發育中的體節中表達, 但通過不同方式調節體節形成[14,15]。Dmrt3在日本河豚[16]和斑馬魚[17]性腺中的表達情況與 Dmrt1類似, 提示其可能參與了性別分化調控和雄性性腺的發育調控, 但 Dmrt3也還在器官發育階段的河豚[16]和斑馬魚神經系統中[17], 以及在熱帶爪蟾的神經系統中表達[18]。在小鼠中, Dmrt3在脊髓的DI6區神經元中表達, 參與神經元在該區特化[19]。Dmrt4在小鼠胚胎期和出生后的發育時期都廣泛性表達, 在精巢和卵巢中表達水平相當[20], 并參與調控嗅覺系統的神經形成[21]。在小鼠中, Dmrt5/Dmrta2主要在腦中表達, 在其他組織中也有微量表達, 但在卵巢中的表達水平高于在精巢中的表達水平。最近的研究表明斑馬魚 Dmrt5/Dmrta2基因除了在發育中的胚胎腦中表達外, 還在成體斑馬魚精巢中表達和調控精子發生[22]。Dmrt6只在腦中檢測到表達[23]。Dmrt7只在性腺中檢測到表達, 但在卵巢中的表達量大于在精巢中的表達量, 可能在雌性生育中起重要作用[24]。

已有的研究表明, 在人類以及小鼠、斑馬魚、青 鳉等模式動物中, Dmrt1、Dmrt2和Dmrt3都具有保守的同線性關系[25], 說明這三個基因可能是通過基因擴增后進化而來的緊密同源基因。Dmrt3既在精巢中表達又在脊髓的神經元中表達, 與 Dmrt4、Dmrt5在神經系統中表達類似, 提示其與這些基因在進化上也有密切的關系。因此, 克隆不同脊椎動物的 Dmrt3基因, 并分析其表達時空模式, 以確定不同脊椎動物Dmrt3基因在基因序列、表達時空模式方面有無共同特征, 進而比較其與脊椎動物其他Dmrt基因在序列上的異同, 對揭示 Dmrt基因家族成員間的進化關系具有關鍵的作用, 對深入研究基因擴增后同源基因的功能分化也具有重要意義。

鯽是我國廣泛養殖的重要食用和觀賞魚類, 并且具有兩性生殖的二倍體亞種和天然雌核發育的多倍體亞種, 是研究魚類生殖控制和基因組進化的獨特材料[26,27]。因此, 克隆鯽的 Dmrt3基因, 并對其在早期發育過程中和不同組織中的表達進行分析,既可為研究其進化提供新的資料, 又可為研究Dmrt3基因在鯽這一我國重要經濟魚類中的功能和在性別控制育種中的價值提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用鯽(Carassius auratus)為兩性生殖的二倍體鯽。雌、雄鯽均于繁殖季節購自杭州市魚類養殖場。雌、雄親本在本實驗室水族箱中分別養殖。在繁殖季節采用人工授精的方法獲取鯽的胚胎, 置于22℃±1℃的環境發育。卵巢、精巢、心臟、肝臟、脾、腎、腦這些成體組織取自活體解剖的鯽。取得這些材料后, 迅速投入液氮冷凍, 并存于－80℃冰箱備用。

1.2 試劑

ExTaq酶、逆轉錄試劑盒和pMD18-T克隆載體試劑盒購自Takara公司, SMARTerTMRACE試劑盒、Genome Walker試劑盒購自 ClonTech公司, CpGenome DNA修飾試劑盒購自Chemicon公司, 膠回收試劑盒購自 Axygen公司, 其余試劑均為國產分析純, PCR引物的合成及核苷酸序列的測定均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.3 總RNA的提取和cDNA第一鏈的獲得

使用總RNA提取試劑盒SV Total RNA Isolation System(Promega)提取鯽發育早期和成體不同組織的總RNA。將溶于無核酸酶水中的RNA置于–80℃冰箱中備用。以提取的總 RNA為模板, 使用 ClonTech公司的 SMARTer RACE試劑盒分別合成 5′和 3′RACE-Ready cDNA, 構建cDNA文庫。具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4 鯽Dmrt3 cDNA的克隆

從 GeneBank中比較多種魚類和其他脊椎類的Dmrt3 cDNA的序列, 從中得到一段140 bp左右的比較保守的區域, 根據保守區域序列設計簡并引物A1和A2(表1)擴增。PCR的反應體系為10 μL, 反應條件為: 預變性94℃, 5min, 變性94℃, 30s, 退火63.5℃, 30s, 延伸 72℃, 30s, 32個循環, 然后延伸7min結束反應。于1.2%瓊脂糖膠上電泳, 確認目的片段之后大體系膠回收, 并克隆到pMD18-T載體上測序。測序結果經過比對確認其的確為Dmrt3的同源片段。然后在得到的測序結果的基礎上設計RGSP1和RGSP2(表1), 按照SMARTer RACE試劑盒的說明進行5′和3′RACE擴增。對所得到的5′端和 3′端的片段進行拼接, 獲得鯽的 Dmrt3基因cDNA全長, 設計 5′端上游正向引物和 3′端下游反向引物DS和DAS(表1), 進行連鎖分析確保片段的正確性。

1.5 氨基酸序列分析和多重比對

根據 Dmrt3核苷酸的序列推測出其氨基酸序列。利用ClustalX軟件, 并結合NCBI的在線蛋白多序列比對工具COBALT進行序列的比對和分析。所需的不同物種DMRT序列在GeneBank上的登錄號見表2。

1.6 半定量和嵌套式RT-PCR分析

反應體系為20 μL, 測定所得RNA的濃度, 定量所有的RNA為1000 ng。以鯽18S rRNA為內參。取逆轉錄cDNA各1 μL, 以引物18S rRNA-F和18S rRNA-R(表1)進行PCR擴增。反應體系為10 μL: 10× ExTaq buffer 1 μL, dNTP 0.8 μL, 18S rRNA-R 0.5 μL, 18S rRNA-F 0.5 μL, ExTaq 0.1 μL, cDNA 1 μL, 水6.1 μL。預變性94℃, 5min, 接著94℃, 30s, 61℃,30s, 72℃, 30s, 28個循環, 然后延伸7min結束反應。反應結束各取5 μL產物經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳, UVP凝膠成像系統拍照, 以產物含量最多的模板為參照, 均一化各個模板的量, 重新確定cDNA的量。確定好內參之后, 以Dmrt3特異性引物B1和B2(表1)確定鯽Dmrt3在成體組織中的表達情況。使用嵌套引物C1和C2(表1), 其位于引物B1和B2引物的內側, 來確定基因在早期胚胎中的表達情況。

表1 克隆鯽Dmrt3 cDNA全長、表達分析和甲基化分析所用的引物Tab. 1 Primers used for cloning, expression and methylation analysis of goldfish Dmrt3

1.7 Dmrt3上游啟動子區的獲得和甲基化分析

按照Genome Walker試劑盒的要求將鯽的基因組 DNA進行酶切消化, 每個樣品和陽性對照各取5 μL進行電泳檢測酶切是否完全。對酶切產物進行純化后連接Genome Walker接頭, 得到鯽的基因組酶切文庫。根據已經得到的Dmrt3的mRNA序列設計三條反向的引物, AP為接頭序列。最后選用GSP3AS和AP1進行首輪PCR: 94℃預變性5min; 94℃, 25s, 72℃, 3min, 7個循環; 94℃, 25s, 67℃, 3min, 32個循環; 67℃, 最后延伸7min, 所得到的PCR產物稀釋20倍, 然后以GSP1AS和AP2進行二輪的巢式PCR: 94℃預變性5min; 94℃, 25s, 72℃, 3min, 5個循環; 94℃, 25s, 67℃, 3min, 20個循環; 67℃, 延伸7min, 擴增得到Dmrt3的上游啟動子序列。

利用網上公開的CpG島預測和甲基化PCR引物設計軟件 MethPrimer, 通過該軟件對啟動子區CpG 島設計亞硫酸氫鹽 PCR引物 Meth-S和Meth-AS(表1)。根據常規的苯酚氯仿有機溶劑抽提DNA的方法提取鯽DNA, 并根據CpGenome DNA修飾試劑盒說明書對基因組 DNA進行亞硫酸氫鈉修飾處理, 之后進行甲基化特異性擴增。

2 結果

2.1 鯽Dmrt3 cDNA的克隆

用 SMARTer RACE試劑盒進行 3′RACE和5'RACE獲得了鯽Dmrt3的cDNA的完整序列。該序列全長為 2182 bp, 其中 5′端非編碼區(5′-UTR) 408 bp, 3′端非編碼區(3′-UTR)427 bp, 開放閱讀框(ORF)1347 bp, 編碼 448個氨基酸。序列已提交至GenBank(登錄號: KC733765)。

表2 本文所引用的不同物種Dmrt在GeneBank中的登錄號Tab. 2 Cited GeneBank accession numbers of various Dmrts

此外, 我們在進行 Dmrt3基因組分析時還在鯽基因組中發現了一個只有部分編碼序列的Dmrt3基因拷貝。該拷貝全長625 bp, 包含起始密碼ATG和polyA加尾信號序列, 在編碼區域有多個終止的密碼。這些特征說明其是一個從mRNA經逆轉錄而來,并已缺失了大部分編碼序列的加工假基因。該假基因已經命名為pDmrt3并也已提交至GenBank(登錄號: KC733764)。

2.2 鯽 DMRT3蛋白結構的預測及進化分析 Dmrt基因家族進化樹的構建

使用Jellyfish軟件, 利用所獲得的Dmrt3核苷酸序列推測出Dmrt3的氨基酸序列如圖1a所示。氨基酸序列同源性分析表明, 鯽 Dmrt3編碼的氨基酸序列和斑馬魚(Danio rerio)的序列同源性為 90.8%,和爪蟾(Xenopus laevis)序列同源性為 64.9%, 和小鼠(Mus musculus)序列同源性為62.3%。利用SMART在線分子結構預測工具(http://smart.embl.de/)對鯽DMRT3的蛋白結構進行預測分析, 結果發現除了DM結構域外, 還有DMA結構域(圖1b)。

圖1 推測的鯽DMRT3氨基酸序列及蛋白質結構示意圖Fig. 1 The putative amino acid sequence and the diagram of the putative conserved domains of goldfish DMRT3

對GenBank數據庫上能搜索到的不同脊椎動物Dmrt家族成員氨基酸序列及得到的鯽Dmrt3推測出來的氨基酸序列進行比對, 將比對的結果導入NCBI, 采用Neighbor Joining方法并利用COBALT工具輔助構了 Dmrt基因家族建進化樹(圖 2)。因DMRT6只有小鼠一個物種的序列信息, 并且其DMRT8序列(ABC48237.1)與Dmrt家族的其他序列存在大于 85%的差異, 在建立進化樹時將它們排除。從構建的進化樹中可以看到鯽的 DMRT3與斑馬魚DMRT3最為接近, 紅鰭東方 鲀和黃鱔聚為同一亞族, 再和斑馬魚-鯽這一支聚為一個大支, 爪蟾和小鼠聚為一支, 再和上述大支聚合, 這與其分類地位是一致的。還可以看出DMRT3、DMRT4、DMRT5在進化上是很接近的, 分為一個大支, DMRT2和DMRT7在進化上親緣關系比較近, DMRT1形成單獨的一支。

2.3 鯽 Dmrt3在早期各個發育時期和各個組織中的表達情況

半定量 RT-PCR分析表明在鯽早期胚胎發育過程中, Dmrt3在尾芽期以前檢測不到表達, 在尾芽期經嵌套式PCR才檢測到微量表達, 到 15體節期其表達量明顯增加但仍然難以經一輪 RT-PCR檢測到(圖3)。在鯽成體組織中, 半定量RT-PCR只在精巢中檢測到 Dmrt3表達, 在卵巢、心臟、肝臟、脾、腎和腦等組織中都未檢測出表達(圖 4)。其中, +RT表示cDNA合成時加入了逆轉錄酶, -RT表示cDNA合成時沒有加入逆轉錄酶。

2.4 鯽Dmrt3啟動區的甲基化分析

鯽Dmrt3只在成體精巢中被檢測到表達, 在卵巢和其他成體組織中都沒有檢測到表達。為了解這種兩性特異性和組織特異性差異表達是否與差異甲基化有關, 我們用在線工具 MethPrimer對鯽的Dmrt3啟動區1207 bp進行分析。分析結果表明在該基因起始密碼子上游啟動子的–215至–71 bp區域內的GC含量大于50%, 符合CpG島的標準。為此, 我們對該 CpG島在鯽的不同組織和配子中的甲基化狀況進行了亞硫酸氫鹽轉換測序分析。結果表明在所有被檢測的鯽組織和配子中, 除極少數克隆中的部分位點發生不穩定的甲基化外, 總體上Dmrt3啟動子區的CpG島不發生甲基化(圖5)。這一結果說明 Dmrt3的性別特異性和組織特異性表達并不是通過對該基因啟動子 CpG島的差異甲基化修飾來調控的。

3 討論

3.1 DMRT3與其他DMRT家族成員的進化關系

氨基酸序列的保守性分析表明鯽DMRT3與其他脊椎動物的DMRT3一樣, 除了具有DMRT家族蛋白所都具有的DM結構域外, 還有DMA結構域。根據序列保守性所進行的不同脊椎動物DMRT3的進化分析表明鯽的DMRT3與斑馬魚DMRT3最為接近,紅鰭東方 鲀和黃鱔聚為同一亞族,再和斑馬魚-鯽這一支聚為一個大支, 爪蟾和小鼠聚為一支, 再和上述大支聚合。這與用傳統方法所進行的物種親緣關系分類結果一致。

圖2 采用Neighbor Joining方法構建的不同物種DMRT家族系統進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of DMRT family generated with Neighbor Joining method

圖3 鯽胚胎發育早期Dmrt3的表達Fig. 3 Dmrt3 expression during early embryogenesis in goldfish

圖4 鯽成體組織中Dmrt3的表達RT-PCR檢測Fig. 4 RT-PCR examination of Dmrt3 expression in various adult tissues of goldfish

在Dmrt基因家族中, Dmrt1、Dmrt2、Dmrt3位于同一個連鎖群上,提示我們這三個基因很可能是通過基因擴增進化而來的緊密同源的基因。但DMRT1、DMRT2中只有DM結構域, 而DMRT3與DMRT4、DMRT5一樣既有DM又有DMA結構域, 而且都在神經系統中檢測到了表達[17,20,23], 提示其與DMRT4、DMRT5在進化上可能存在更為直接的關系。進化樹表明 DMRT3、DMRT4與DMRT5在進化上的親緣關系的確更近(圖2)。由于DMA結構域被認為是更古老的結構域[28],因此DMRT3可能是比DMRT1和DMRT2更原始的基因。在脊椎動物基因擴增和整個基因組加倍后冗余基因的進化過程中, 一般只有原始的多功能基因通過冗余基因拷貝以互補的方式分享其原始基因的功能而產生新的基因[29,30]。因而Dmrt3可能是Dmrt基因家族中原始的多功能基因。Dmrt1和Dmrt2、Dmrt3的連鎖關系提示Dmrt1和Dmrt2可能是Dmrt3基因擴增后功能分化產生的新基因。位于不同染色體上的 Dmrt3、Dmrt4和 Dmrt5基因所編碼的蛋白都具有 DM 和DMA兩個結構域, 提示這些基因是經歷基因組加倍后分化而產生的新基因。

圖5 Dmrt3啟動子CpG島在胚胎和不同成體組織中的甲基化狀態Fig. 5 Methylation state of Dmrt3 promoter CpG island in embryo and various adult tissues

3.2 鯽Dmrt3的表達與在發育過程中的可能功能

鯽Dmrt3在早期胚胎發育階段沒有檢測到表達,尾芽期開始檢測到微量表達, 在此之后其表達水平逐步提高, 到 15體節期可以檢測到較高水平的表達。這種表達時間模式與斑馬魚中類似, 但在鯽中該基因在胚胎發育階段的表達水平顯然比在同期斑馬魚胚胎中要低, 即使到15體節期也需要用嵌套式PCR才能檢測到。因此, 我們沒有做進一步的組織特異性表達原位雜交分析。由于已有的研究表明在DMRT家族中, 具有DMA結構域的DMRT3、DMRT4、DMRT5能在神經系統的相關器官中表達[16,17], 提示鯽的 DMRT3也可能在器官發生階段在神經系統的發育調控中起作用。

在鯽成體組織中, 所檢測7種組織中Dmrt3只在精巢中表達(圖4)。這與日本河豚魚Dmrt3在精巢中表達[16]相同, 但與斑馬魚Dmrt3在精巢和卵巢中都有表達[17]存在差異。這些觀察結果提示Dmrt3的功能在鯽和日本河豚中可能比在斑馬魚中有了進一步的限定, 在成體階段只保留了調控雄性性腺發育的功能。因此, 在深入了解鯽 Dmrt3基因在雄性性腺發育調控中的功能和機制后, 可用于鯽雄性控制育種。

對Dmrt3啟動子CpG島的甲基化分析表明所檢測的組織和配子中并不發生甲基化, 說明鯽中Dmrt3雌雄特異性和組織特異性差異表達并不是通過對該基因啟動子的差異甲基化修飾來調控的。由于Dmrt1、Dmrt2、Dmrt3位于同一個連鎖群上, 這些基因的表達是否有共同的調控元件和調控機制還不清楚, 因此, 不能排除其他 Dmrt基因如果發生差異甲基化對Dmrt3雌雄特異性差異表達的可能影響。

[1] Raymond C S, Shamu C E, Shen M M, et al. Evidence for evolutionary conservati-on of sex-determining genes [J]. Nature, 1998, 391(6668): 691—695

[2] Burtis K C, Baker B S. Drosophila doublesex gene controls somatic sexual differen-tiation by producing alternatively spliced mRNAs encoding related sex-specific poly-peptides [J]. Cell, 1989, 56(6): 997—1010

[3] Erdman S E, Burtis K C. The Drosophila doublesex proteins share a novel zinc finger related DNA binding domain [J]. The EMBO Journal, 1993, 12(2): 527—535

[4] Smith C A, McClive P J, Western P S, et al. Evolution: Conservation of a sex-deterining gene [J]. Nature, 1999, 402(6762): 601—602

[5] Raymond C S, Kettlewell J R, Hirsch B, et al. Expression of Dmrt1 in the genital ridge of mouse and chicken embryos suggests a role in vertebrate sexual developme[J]. Developmental Biology, 1999, 215(2): 208—220

[6] Alam M A, Kobayashi Y, Horiguchi R, et al. Molecular cloning and quantitative expression of sexually dimorphic markers Dmrt1 and Foxl2 during female-to-male sex change in Epinephelus merra [J]. General and Comparative Endocrinology, 2008, 157(1): 75—85

[7] Wen A Y, You F, Sun P, et al. Cloning of dmrt1 gene and its tissue expression analyses compared with that of P450arom gene in olive flounder (Paralichthys olivaceus) [J]. Marine Sciences, 2010, 34(11): 97—102 [文愛韻, 尤鋒, 孫鵬, 等.牙鲆dmrt1基因的克隆及其與P450arom基因的組織表達分析. 海洋科學, 2010, 34(11): 97—102]

[8] Deng S P, Chen S L. Molecular cloning, characterization and RT-PCR expression analysis of Dmrt1α from half-smooth tongue-sole, Cynoglossus semilaevis [J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2008, 15(4): 577—584 [鄧思平, 陳松林.半滑舌鰨Dmrt1α基因的cDNA克隆及其表達. 中國水產科學, 2008, 15(4): 577—584]

[9] Deng S P, Wang J J, Wu T L, et al. cDNA cloning and expression analysis of Dmrt1 in Clarias fuscus [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(4): 610—617 [鄧思平, 王靜杰, 吳天利, 等. 胡子鲇Dmrt1基因全長cDNA克隆及其表達分析. 水生生物學報, 2012, 36(4): 610—617]

[10] Cao M, Duan J, Cheng N, et al. Sexually dimorphic and ontogenetic expression of dmrt1, cyp19a1a and cyp19a1b in Gobiocypris rarus [J]. Comparative Biochemistry and Physiology-Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2012, 162(4): 303—309

[11] Xia W, Zhou L, Yao B, et al. Differential and spermatogenic cell-specific expressionof DMRT1 during sex reversal in protogynous hermaphroditic groupers [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2007, 263(1): 156—172

[12] Winkler C, Hornung U, Kondo M, et al. Developmentally regulated and non-sex-specific expression of autosomal dmrt genes in embryos of the Medaka fish (Oryzias latipes) [J]. Mechanisms of Development, 2004, 121(7): 997—1005

[13] Zhou X, Li Q, Lu H, et al. Fish specific duplication of Dmrt2: Characterization of zebrafish Dmrt2b [J]. Biochimie, 2008, 90(6): 878—887

[14] Meng A, Moore B, Tang H, et al. A Drosophila doublesex-related gene, terra, is involved in somitogenesis in vertebrates [J]. Development, 1999, 126(6): 1259—1268

[15] Liu S, Li Z, Gui J F. Fish-specific duplicated Dmrt2b contributes to a divergent fun-ction through Hedgehog pathway and maintains left-right asymmetry establishment f-unction [J]. PLoS One, 2009, 4(9): e7261

[16] Yamaguchi A, Lee K H, Fujimoto H, et al. Expression of the DMRT gene and its roles in early gonadal development of the Japanese pufferfish Takifugu rubripes [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics, 2006, 1(1): 59—68

[17] Li Q, Zhou X, Guo Y, et al. Nuclear localization, DNA binding and restricted expression in neural and germ cells of zebrafish Dmrt3 [J]. Biology of the Cell, 2008, 100(8): 453—463

[18] Lu Y, Li Z, Zhu X L, et al, Molecular cloning and characterization of Dmrt3 during xenopus tropicalis embryogenesis [J]. Journal of Zhejiang University (Science Edition), 2012, 39(5): 564—570 [陸怡, 李政, 朱曉龍, 等.熱帶爪蟾Dmrt3基因的克隆及在早期胚胎發育中的表達.浙江大學學報 (理學版), 2012, 39(5): 564—570]

[19] Andersson L S, Larhammar M, Memic F, et al. Mutations in DMRT3 affect locomotion in horses and spinal circuit function in mice [J]. Nature, 2012, 488(7413): 642—646

[20] Balciuniene J, Bardwell V J, Zarkower D. Mice mutant in the DM domain gene Dmrt4 are viable and fertile but have polyovular follicles [J]. Molecular and Cellular Biology, 2006, 26(23): 8984—8991

[21] Huang X, Hong C S, O'Donnell M, et al. The doublesex-related gene, XDmrt4, is required for neurogenesis in the olfactory system [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(32): 11349—11354

[22] Xu S, Xia W, Zohar Y, et al. Zebrafish dmrta2 regulates the expression of cdkn2c in spermatogenesis in the adult testis [J]. Biology of Reproduction, 2013, 88(1): 1—12

[23] Kim S, Kettlewell J R, Anderson R C, et al. Sexually dimorphic expression of multiple doublesex-related genes in the embryonic mouse gonad [J]. Gene Expression Patterns, 2003, 3(1): 77—82

[24] Matsushita Y, Oshima Y, Nakamura M. Expression of DMRT genes in the gonads of Rana rugosa during sex determination [J]. Zoological Science, 2007, 24(1): 95—99

[25] Brunner B, Hornung U, Shan Z, et al. Genomic organization and expression of the doublesex-related gene cluster in vertebrates and detection of putative regulatory regions for DMRT1 [J]. Genomics, 2001, 77(1): 8—17

[26] Gui J F, Zhou L. Genetic basis and breeding application of clonal diversity and dual reproduction modes in polyploid Carassius auratus gibelio [J]. Science China Life Sciences, 2010, 53(4): 409—415

[27] Ge W, Jiang Y G. The natural gynogenesis of fish [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 1989, 13(3): 274—286 [葛偉, 蔣一珪. 魚類的天然雌核發育. 水生生物學報, 1989, 13(3): 274—286]

[28] Volff J N, Zarkower D, Bardwell V J, et al. Evolutionary dynamics of the DM domain gene family in metazoans [J]. Journal of Molecular Evolution, 2003, 57(1): S241—S249

[29] Force A, Lynch M, Pickett F B, et al. Preservation of duplicate genes by complementary, degenerative mutations [J]. Genetics, 1999, 151(4): 1531—1545

[30] Kleinjan D A, Bancewicz R M, Gautier P, et al. Subfunctionalization of duplicated zebrafish pax6 genes by cis-regulatory divergence [J]. PLoS Genetics, 2008, 4(2): e29

MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION ANALYSIS OF DMRT3 IN GOLDFISH, CARASSIUS AURATUS

WANG Jia and LUO Chen
(Collage of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

The DMRT family of transcription factors play a pivotal role in sex determination. In order to investigate the function of Dmrt3, a member of the DMRT family, in the embryogenesis and sex differentiation, as well as its potential implication in breeding of goldfish, we cloned the full length cDNA of Dmrt3 and analyzed its expression during the early embryogenesis and in various adult tissues in goldfish, Carassius auratus. The entire goldfish Dmrt3 cDNA is 2182 bp long, including a 408 bp 5′-UTR, a 427 bp 3′-UTR and a 1347 bp open reading frame (ORF); the latter encoded a protein with 448 amino acids. Protein structural prediction based on the putative amino acid sequence of DMRT3 revealed that goldfish DMRT3 contained a common DM domain and a DMA domain, suggesting that it was more phylogenetically related to DMRT4 and DMRT5. Nested PCR examination indicated that the expression of Dmrt3 was undetectable until bud stage, and its expression obviously increased but still at a low level at 15-somite stage. In adult tissues, DMRT3 was expressed exclusively in the testes. This expression pattern suggested that Dmrt3 might regulate organogenesis and gonad development of male. No methylation of the Dmrt3 promoter CpG-island in gametes and in various tissues was observed using bisulfite sequencing analysis, suggesting that DNA methylation did not regulate the sex-specific and tissue-specific expression of Dmrt3. Moreover, we identified a pseudogene, named pDmrt3, from the reverse transcript of Dmrt3. These results provide essential materials for studying the function of Dmrt3 in the sex differentiation and potential application in breeding of goldfish, as well as the evolutionary relationship of Dmrt genes.

Goldfish; Dmrt3; Gene cloning; Gene expression

Q781

A

1000-3207(2014)03-0548-08

10.7541/2014.77

2013-05-09;

2013-12-20

國家973項目(編號: 2010CB126301); 浙江省科技重大專項(2012C12907-9)資助

王佳(1989—), 男, 陜西渭南人; 碩士; 主要從事發育生物學研究。E-mail: wangjia1019@163.com

羅琛; E-mail: luoc@zju.edu.cn