生草對渭北旱地蘋果園土壤有機碳組分及微生物的影響

劉富庭， 張林森*， 李雪薇， 李丙智， 韓明玉， 谷 潔， 王曉琳

(1 西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌 712100； 2 西北農林科技大學資源環境學院，陜西楊凌 712100)

diversity of soil microbial community

黃土高原是中國蘋果兩大優產區之一，以渭北地區為代表的黃土高原蘋果產業已成為促進區域經濟發展、改善生態環境的支柱產業。本地區蘋果生產中存在的一個突出問題是果園土壤干旱和有機質含量偏低，對果實品質影響較大。因此，在大部分沒有灌溉條件的旱地果園，如何提高果園的土壤有機質含量、加速有機質的轉化是重點關注的問題。近幾年，由于果園生草具有蓄水保墑、培肥地力、調節果園小氣候等作用[1-3]，因此得到試驗推廣。但是，生草對蘋果園土壤有機質的含量及其組分轉化和土壤微生物群落的影響還不十分清楚。特別是土壤微生物往往有累積效應或長期效應，短時間內不容易觀察到，需要長期實施農業管理措施后才能顯現。因此，研究生草對蘋果園土壤有機質及微生物的影響對于本地區蘋果產業持續健康發展具有重要意義。

土壤有機質中所含的碳稱為土壤有機碳(soil organic carbon，SOC)，是評價土壤質量的一個重要指標[4]。土壤活性有機碳(labile organic carbon，LOC)較總有機碳對農業管理措施改變而導致的變化反應更迅速[5-6]。因此，其更可能作為反映土壤質量變化的敏感性指標。土壤活性有機碳通常包括顆粒有機碳、熱水提取有機碳、微生物量碳和易氧化有機碳等[7]。而土壤微生物是土壤有機物轉化的執行者，又是植物營養元素的活性庫[8-9]。微生物群落結構或微生物多樣性，與土壤可持續利用的關系可能更密切，更能敏感地反映土壤質量的變化[10]，并具有較好的時效性，作為土壤質量的生物活性指標已被廣泛接受。目前我國對果園生草的研究大多是關于土壤理化性狀、果園生態環境及果實品質等方面，關于果園生草條件下對土壤碳庫影響的研究較少，已有的研究工作也多集中在土壤總碳的變化，而對活性有機碳的關注甚少，有關土壤微生物群落多樣性的研究主要側重于不同土壤類型、施肥措施、植被根系等[11-14]，生草方式對土壤微生物群落多樣性的影響缺乏系統的研究。本研究將生草技術引入旱作果園土壤管理中，對比分析生草條件下對蘋果園土壤有機碳各組分及微生物的影響，為生草措施在果園中的進一步推廣應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

1.2 試驗設計

試驗于2009年3月進行。行間種草，寬度為3 m。試驗設毛苕子(Viciavillosa)、白三葉(Trifoliumrepens)、黑麥草(Loliumperenne)和早熟禾(Poapratensis)及清耕(CK)5個處理。重復3次，隨機區組設計，每小區面積為12 m×14 m。四種牧草播種量均為7.5 kg/hm2，連續生草4年，各小區除試驗處理外其它管理措施一致，施肥均在果樹根部，行間不施肥。生草區每年刈割3次，覆蓋于果樹行間。

1.3 土樣的采集和預處理

2012年10月初每個處理小區內隨機選取10個點，分別采集0—20 cm、20—40 cm、40—60 cm、60—80 cm、80—100 cm土層土壤，同一小區的同層土樣均勻混合作為一個單獨樣本，剔除土壤樣品中石礫等雜物。然后將采集土樣分成兩份，其中一份田間剛采集的濕潤土樣混勻過2 mm 篩，裝入塑封袋中，冰盒中保存，12 h內運回實驗室放入4℃冰柜中，次日開始分析； 另一部分土壤樣品風干后過2 mm篩，保存。對采集土樣及時進行土壤有機碳組分和土壤微生物碳源利用多樣性的測定分析。

1.4 測定項目和方法

1.4.1 土壤輕質有機碳(LFOC)的測定 稱取風干土樣25 g 于100 mL 離心管中，然后加入比重為1.7 g/cm3的NaI 溶液50 mL，于200 r/min 條件下振蕩1 h。然后以1000×g轉速下離心20 min，將浮在NaI 表層的輕質部分傾倒于裝有0.45 μm 纖維濾膜的過濾器中進行抽濾。然后用蒸餾水將濾膜表面附著的輕質有機質轉移至燒杯。隨后向該離心管中再加入50 mL 質量濃度為1.70 g/mL 的NaI 溶液進行第二次浸提，方法同上。將2 次取得的輕質有機質合并，依次再用0.01 mol/L CaCl2和蒸餾水抽濾沖洗，轉移至燒杯，在60℃下烘干、稱質量。烘干的輕質有機質用瑪瑙研缽研細過0.15 mm 篩后保存，用島津TOC-SSM-5000A 碳分析儀測定。

1.4.2 土壤顆粒有機碳(POC)測定 取25.00 g 風干土，過2 mm 孔徑土壤篩，放入250 mL 塑料瓶，加100 mL質量濃度為5 g/L 的( NaPO3)6溶液，先手搖3 min，再用往復式振蕩器(90 r/min 轉速) 振蕩18 h。把土壤懸液過53 μm 篩，反復用蒸餾水沖洗，取所有留在篩子上的物質，在60℃烘48 h 至恒重，用島津TOC-SSM-5000A 碳分析儀測定。

1.4.5 可溶性有機碳(DOC)測定 取10 g 新鮮土樣，按照土 ∶水為1 ∶5的比例混勻，在25℃條件下，以250 r/min 的速度振蕩1 h，接著在轉速為15000 r/min離心10 min，上部懸浮液過0.45 μm薄濾膜，過濾液用Liquic TOC II有機碳分析儀測定。

1.4.7 土壤微生物群落功能多樣性分析 土壤微生物碳源利用多樣性應用BIOLOG 生態測試板(ECO MicroPlate，美國Matrix Technologies Corporation 生產)測定。BIOLOG 分析在采樣后48 h內進行。稱取相當于5 g烘干土重的新鮮土樣加入內有45 mL 無菌水的三角瓶中，加無菌棉花塞，振蕩30 min 后，按逐步稀釋法，依次稀釋為10-2、10-3梯度液。用10-3稀釋液接種ECO生態測試板，接種量為150 μL，每樣1板，每板3 次重復。將接種好的測試板加蓋，在(25±1)℃下連續培養10 d，每隔24 h 用BIOLOG 自動讀數裝置在590 nm 下讀數。

1.5 數據處理

1.5.1 孔平均顏色變化率(average well-color development，AWCD)

AWCD = Σ(Ci - R)/31

式中，Ci 為各反應孔在590 nm 下的光密度值；R 為ECO 板對照孔A1 的光密度值；Ci-R<0 的孔均在計算中記為零，即Ci-R的值均≥0。采用孔平均顏色變化率法測定土壤微生物利用單一碳源的能力。

1.5.2 群落Shannon 指數(H)

H = -ΣPi×lnPi

式中，Pi =(Ci - R)/Σ(Ci - R)，表示有碳源的孔與對照孔A1 的光密度值之差與整板總差的比值。

1.5.3 群落豐富度指數(S) 用碳源代謝孔的數目(AWCD>0.2 則代表該孔碳源被利用，該孔即為反應孔)表示群落豐富度指數。

采用豐富度指數和多樣性指數表征土壤微生物群落功能多樣性。本試驗采用BIOLOG 微平板培養96 h的數據進行統計分析。

1.5.4 數據統計分析 經Excel整理后，采用SPSS17.0軟件包進行統計方差分析，用SigmaPlot10.0軟件完成繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同生草處理對土壤有機碳各組分的影響

圖1 生草對土壤總有機碳含量的影響Fig.1 Effects of planting grasses on total organic carbon (TOC) content in soil

2.1.2 土壤顆粒有機碳 圖2表明，處理區和對照區土壤顆粒有機碳(POC)含量亦隨土壤深度增加而降低。與清耕相比，蘋果樹行間種草使0—40 cm土層土壤POC含量顯著升高。在0—20 cm 表層土壤中，毛苕子和白三葉處理區的土壤POC含量增幅較大，與CK相比，分別增加了0.33 g/kg和0.28 g/kg，而黑麥草和早熟禾處理增幅較小，只增加了0.20 g/kg和0.14 g/kg，而同一科屬的處理間沒有顯著性差異。在20—40 cm土層中，種植毛苕子處理的POC含量最高，黑麥草和早熟禾處理次之，白三葉的POC含量最小。與CK相比，四種生草處理的POC含量分別增加了54%、37%、32%和30%。毛苕子的POC含量顯著高于其他三種牧草，而白三葉、黑麥草和早熟禾處理間差異不顯著。40—100 cm土層中，各處理間POC含量沒有顯著差異。這表明牧草豐富的根系對表層土壤土粒的纏繞、串連固結以及根際沉積物對土粒的團聚膠結十分有利，促進了顆粒有機碳的形成。

圖2 生草對土壤顆粒有機碳含量的影響Fig. 2 Effects of planting grasses on particulate organic carbon (POC) content in soil

2.1.3 土壤輕質有機碳 從圖3可以看出，各生草處理中，土壤輕質有機碳(LFOC)含量亦隨土層深度的增加而呈現降低趨勢。在0—40 cm土層中生草處理的土壤LFOC含量與清耕處理差異明顯。表層土壤中，豆科牧草毛苕子和白三葉的LFOC含量顯著高于禾本科牧草黑麥草和早熟禾，但同一科屬的處理間差異不顯著。而在亞表層土壤中，毛苕子的LFOC含量顯著高于其他三種生草處理，其中，黑麥草和早熟禾的LFOC含量略高于白三葉，但差異不明顯。這與四種生草處理對土壤POC含量的影響結果一致。40cm以下土層中各生草處理后的LFOC含量與CK相比差異不明顯。上述結果表明，生草可以顯著增加果園0—40 cm土層土壤的LFOC含量。

圖3 生草對土壤輕質有機碳含量的影響 Fig.3 Effects of planting grasses on soil light fraction organic carbon (LFOC) content

2.1.4 土壤易氧化有機碳 由圖4可見，與土壤TOC情況一致，土壤易氧化有機碳(ROC)含量隨土壤深度的增加而降低。在0—20 cm 表層土壤中，毛苕子ROC含量最高，白三葉次之，黑麥草和早熟禾最小。土壤ROC含量大小排序依然是豆科牧草>禾本科牧草。而在亞表層土壤中，土壤ROC含量大小排序為：毛苕子>黑麥草>早熟禾>白三葉>清耕，這與前面研究的POC、LFOC變化趨勢一致。同樣，在40—100 cm土層中，各處理沒有顯著性差異。

圖4 生草對土壤易氧化有機碳含量的影響Fig.4 Effects of planting grasses on soil readily oxidizable organic carbon (ROC) content

2.1.5 土壤可溶性有機碳 從圖5可以看出，生草顯著增加了土壤0—40 cm土層的土壤可溶性有機碳(DOC)含量。0—20 cm土層中，種植豆科牧草的土壤DOC含量明顯高于禾本科牧草，最高含量可達286.4 mg/kg。同樣在0—40 cm土層中，種植毛苕子處理的土壤DOC含量顯著高于其他三種生草處理，與清耕相比，提高了27%。由此可見，豆科類牧草較禾本科牧草更加有利于提高土壤DOC的含量。40 cm以下土層中，各處理間的土壤DOC含量差異不明顯。

圖5 生草對土壤可溶性有機碳含量的影響Fig.5 Effects of planting grasses on soil dissolved organic carbon (DOC) content

圖6 生草對土壤微生物碳含量的影響Fig. 6 Effects of planting grasses on soil microbial biomass organic carbon (MBC) content

2.2 不同生草處理對土壤微生物群落功能多樣性的影響

2.2.1 ELISA 反應平均顏色變化率(AWCD) AWCD表征微生物群落碳源利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的一個重要指標，反映了土壤微生物活性、微生物群落生理功能多樣性。土壤連續培育10 d，每隔24 h 測得的ELISA(酶聯免疫吸附測定法，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)反應AWCD 值變化(圖7)，分析發現AWCD隨培養時間的延長而提高，各處理的AWCD 在24 h之前很小，說明在24 h之內碳源基本未被利用；培養24 h 后AWCD 快速升高，反映出此后碳源被大幅度利用，其中毛苕子處理的增長斜率最大。由圖7可知，在培養結束時，生草處理的AWCD 均高于清耕(CK)處理，與CK處理差異顯著(P<0.05)，這表明生草能顯著提高AWCD 值，而豆科牧草提高AWCD值更加明顯。

圖7 生草處理的平均顏色變化率 Fig.7 AWCD of planting grasses treatments

2.2.2 土壤微生物群落多樣性指數分析 土壤微生物群落功能多樣性是土壤微生物群落狀態與功能的指標，反映土壤中微生物的生態特征。從表1可以看出，BIOLOG 微平板培養96 h 時，毛苕子、白三葉、黑麥草和早熟禾處理的AWCD分別是清耕(CK)的3倍、 2.74倍、 2.02倍和1.85倍(P<0.05)。其中，毛苕子和白三葉豆科牧草處理區的AWCD值顯著高于禾本科牧草(P<0.05)。

不同生草處理的微生物群落Shannon 指數(H)進行比較，毛苕子、白三葉、黑麥草和早熟禾處理較清耕(CK)處理均顯著提高(P<0.05)。其中，毛苕子處理的微生物群落Shannon 指數(H)最高，與黑麥草、早熟禾處理相比，差異顯著(P<0.05)。而與白三葉處理的微生物群落Shannon 指數(H)沒有顯著差異。

從不同處理的微生物群落豐富度指數(S)看，豆科植物和禾本科植物處理區的微生物群落豐富度指數(S)均高于清耕(CK)處理。其中毛苕子處理較高，與清耕(CK)差異顯著(P<0.05)，白三葉次之，黑麥草和早熟禾最低。這表明種植豆科牧草毛苕子和白三葉與禾本科牧草黑麥草和早熟禾都可以提高土壤微生物群落的豐富度和功能多樣性，而毛苕子對土壤微生物群落的豐富度和功能多樣性效果更好一些，與黑麥草和早熟禾相比差異明顯(P<0.05)。

表1 土壤微生物群落多樣性指數分析Table 1 Analyses of soil microbial communities diversity index

注(Note): 同列數據后不同字母表示差異顯著(P<0.05)Values followed by different letters in the same column are significantly different (P<0.05).

圖8 31種主成分方差貢獻率Fig.8 Variance percent of 31 principal components

圖9 生草處理土壤微生物群落的主成分分析Fig.9 Principal component analysis of soil microbial community in planting grasses treatments

3 討論與結論

果園生草是指在果樹行間或全園(樹盤除外)種植草本植物作為地表覆蓋的一種土壤管理模式，是人工構建的具有多物種、多層次、多時序的復合系統[1]。本研究結果表明，生草處理增加了0—40 cm土壤TOC、POC、LFOC、ROC、DOC和MBC的含量。生草處理中，主要是生草產生的大量枯落物和根系等有機物料的添加，提供了可供降解的有機碳源，從而保證了有機物質的充分供應。此外，生草可以有效地覆蓋土壤表層，減少了對土壤表層的擾動，避免了有機碳因長期暴露在空氣中而被氧化和風蝕，這也有助于減少土壤表層有機碳的損失[15]。而且，在干旱半干旱地區，降水的季節分布差異很大，由此導致頻繁的土壤干濕交替對有機碳在土壤中的累積也有重要影響。干濕交替容易使土壤團聚體破裂，使土壤有機碳的礦化分解量增加[16]。而生草可以蓄水保墑，減小土壤溫、濕度的變化幅度[3]，從而起到提高土壤有機碳的作用。

土壤有機碳各組分含量隨著土壤深度的增加而降低的特點與果樹、牧草等的枯落物、牧草的地上地下物質分配、根系深度和根生物量密切相關。土壤有機碳主要來源于枯落物和根系分解所產生的有機質，因此它們的分布變化將影響土壤有機碳輸入的模式、速度、質量和數量[17]。果園-牧草生態系統中，枯落物集中在土壤表層，植被根系也主要集中在0—40 cm土層，所以在0—40 cm的土壤枯落物和根系被微生物分解產生的各種有機碳組分相對集中，尤其集中在表層(0—20 cm)土壤，相應的有機碳含量就會高于下層。因此有機碳各組分表現出隨土層深度的增加而遞減的趨勢，這與前人大部分研究結果相一致[18-20]。

土壤微生物是土壤有機質的活性庫，在土壤有機質的分解和養分循環中起重要作用，是反映土壤微生物活性的直接指標[21]。已有研究[22]表明，行間生草可以增加黃土高原地區果園土壤微生物的數量。這與本研究結果基本一致，果園生草處理后，顯著增加了土壤微生物的活性和微生物群落生理功能多樣性(P<0.05)，與土壤微生物量碳顯著增加相一致。由于生草處理改善了土壤的溫度和水分條件，為微生物的生長營造了良好的生存環境，減少了對土壤的擾動，果園及牧草根莖系統的分泌物和枝葉殘體為土壤中微生物的活動提供了必需的營養物質[1]，有利于微生物的生長繁殖。

由本研究結果可以看出，豆科牧草白三葉和毛苕子處理的土壤微生物活性和微生物群落生理功能多樣性顯著高于禾本科牧草黑麥草和早熟禾。豆科牧草根系共生的根瘤菌固氮能力強于禾本科牧草，前人的大量研究表明，果園種植的豆科作物的固氮作用可以提高土壤N的凈輸入，使土壤氮含量升高[23-25]。惠竹梅等[26]通過土壤微生物量與土壤養分的通徑分析表明，土壤全氮和堿解氮是影響微生物量碳的直接因子，從而得出土壤中氮素含量較高、有機質含量適當時，有利于土壤微生物量積累和微生物活性提高的結論。齊雁冰等[27]研究同樣指出，在土壤有機質和全氮提高的同時，C/N的降低可以提高微生物活性，加快有機質的分解礦化。另外，趙政陽等[28]研究表明，禾本科牧草黑麥草的土壤有效磷含量顯著高于豆科牧草白三葉，而黎寧等[29]研究指出，偏高的有效磷/堿解氮比例對微生物生長不利，土壤養分比例會對土壤微生物產生影響。這可能是豆科牧草的微生物量和微生物活性顯著高于禾本科牧草的原因。

在生草處理0—20 cm的表層土壤中，豆科牧草白三葉和毛苕子的土壤有機碳含量顯著高于禾本科牧草黑麥草和早熟禾，原因可能是豆科牧草提供的養分環境更加適合土壤微生物的生長。土壤微生物量升高，促進土壤有機質的更新與活化，進而使土壤活性有機碳含量也會隨之升高。禾本科植株的C/N值大于豆科植物，而有研究結果指出，有機殘體的碳氮比較大時會限制微生物的生長繁殖及有機殘體的分解[30]。本研究在豆科與禾本科植株的碳含量測定中，豆科牧草毛苕子、白三葉的干物質含碳量分別為35.18%和34.72%，禾本科牧草黑麥草和早熟禾的干物質含碳量分別為33.51%和31.64%，而四種牧草的干草年產量分別為8350、7200、6940、6230 kg/hm2，這說明雖然豆科牧草植株C/N值小于禾本科植物，但豆科牧草的總碳量明顯高于禾本科，從而為微生物提供更多的碳源。在20—40 cm土層土壤中，表現出白三葉處理的活性有機碳含量低于禾本科牧草黑麥草和早熟禾。白三葉根系較淺，而毛苕子、黑麥草及早熟禾的根系相對較深，在20—40 cm土層中的根系分布前者要小于后三種牧草。于寒青等[31]研究認為，較為發達的根系可為土壤微生物棲息提供更好的場所，并產生更多根系分泌物促進土壤微生物活動，使得有機殘體分解更強烈。Vepsalainen等[32]研究同樣表明，根系殘體和根系分泌物有利于微生物生長繁殖，促進微生物活性提高，而微生物量的提高反過來影響土壤活性有機碳的含量升高。

李會科等[33]指出，在西北干旱半干旱的果園區選擇根系淺的三葉草作為果園生草品種為宜。而霍穎等[34]的研究表明，在北京地區種植黑麥草比種三葉草效果要好。出現這兩種截然不同的研究結果的原因可能與地域環境有關。選用生草品種應根據不同地區的環境氣候等因素而定。本研究結果表明，豆科牧草毛苕子提高有機碳和微生物含量明顯，所以在無灌溉條件的渭北旱地蘋果園種植產草量較大的毛苕子效果較好，其次為白三葉。但是，生草在我國果園應用的時間較短，相關研究也處于起步階段，許多問題還亟待解決，不同草種地上地下部生物干物質降解對有機碳各組分的貢獻以及微生物的具體轉化機理還需要進一步深入研究。

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