慢性HBV感染患者血清IL-35含量和外周血Treg細胞的變化及意義

劉志華，齊青松，張志安，張曉靜

（廣東醫(yī)學院附屬厚街醫(yī)院感染科，廣東東莞 523945）

慢性HBV感染患者血清IL-35含量和外周血Treg細胞的變化及意義

劉志華，齊青松，張志安，張曉靜

（廣東醫(yī)學院附屬厚街醫(yī)院感染科，廣東東莞 523945）

目的研究血清IL-35和外周血Treg細胞含量在慢性乙型肝炎(HBV)患者中的作用及意義。方法選取廣東醫(yī)學院附屬厚街醫(yī)院感染科慢性HBV感染患者40例[(其中慢性乙肝無癥狀攜帶者(AsC)8例，慢性乙肝輕、中度患者(CHB-LM)20例和慢性乙肝重型患者(CSHB)12例]作為實驗組。同時選取本院體檢科健康志愿者(HV)15例作為對照組。采用ELISA方法檢測血清IL-35含量，流式細胞術檢測外周血Treg細胞含量，Pearson相關分析兩者的相關性。結果HBV患者血清IL-35含量[(75.00±6.75)pg/ml]顯著高于健康志愿者血清IL-35含量[(44.13±4.49)pg/ml]，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.05)。CSHB組和CHB-LM組血清IL-35含量均明顯高于AsC組(P＜0.05)；CSHB組和CHB-LM組間血清IL-35含量差異無統計學意義(P＞0.05)。HBV患者外周血Treg細胞含量[(6.45±0.42)%]顯著高于健康志愿者外周血Treg細胞含量[(3.07±0.31)%]，兩者比較差異有統計學意義(P＜0.05)。CSHB組Treg細胞含量明顯高于CHB-LM組和AsC組Treg細胞含量(P均＜0.05)。CHB-LM組Treg細胞含量明顯高于AsC組Treg細胞含量(P＜0.05)。HBV患者血清IL-35含量與外周血Treg細胞含量呈正相關(P＜0.05)。結論血清IL-35和外周血Treg細胞含量在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病階段存在差異，可能在HBV發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

調節(jié)性T細胞；白細胞介素 35；慢性乙型肝炎

急性和慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染仍是重要的全球性健康問題，目前全球仍約有4億慢性HBV感染者[1]。適應性免疫應答反應在慢性HBV感染中起著至關重要的作用，特別是Th17/Treg細胞的平衡關系與HBV感染疾病進展及預后關系密切[2]。免疫抑制性細胞因子IL-35具有擴增并促進Treg分化，抑制Th17細胞亞群分化、增殖，防止過度自身免疫反應等的作用[3]。近年來，越來越多的研究也表明Treg細胞在自身免疫性疾病及慢性感染性疾病中扮演更重要的作用[2，4]。目前國內外關于IL-35在肝病尤其是HBV感染致病機制中的研究尚少。因此，本文以慢性HBV感染患者為研究對象，旨在研究IL-35和Treg細胞在慢性乙型肝炎患者中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2011年8月至2012年10月于我院感染科確診的慢性乙型肝炎病毒患者40例及同期體檢科健康志愿者(Healthy volunteers，HV)15例作為對照組。40例HBV患者中男性23例，年齡20～55歲，平均(32±1.4)歲；女性17例，年齡22～58歲，平均(33±1.7)歲；15例HV組中男性9例，年齡20～45歲，平均(30±1.3)歲；女性6例，年齡20～40歲，平均(31±1.5)歲；各組男女比例及年齡比較差異均無統計學意義。根據疾病進展程度患者組分為三組，即慢性乙肝無癥狀攜帶者(Asymptomatic carriers of chronic hepatitis B，AsC)8例；慢性乙肝輕、中度患者(Chronic hepatitis B with low and moderate patients，CHB-LM) 20例和慢性乙肝重型患者(Chronic severe hepatitis B，CSHB)12例。所有研究對象均無合并HIV感染、其他肝炎病毒感染、真菌或細菌感染、自身免疫性肝病和肝細胞癌等。所有患者1年內均未使用核苷類似物或者干擾素抗病毒治療。所有對象均采用肝素管空腹采血5 ml。

1.2 樣本處理將采集的5 ml血1 000 r/min，離心5 min后收集上清，以100 μl每管保存于-80℃冰箱用于ELISA檢測。以兩倍體積的Hanks緩沖液稀釋細胞沉淀后，用密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)用于流式細胞分析。

1.3 ELISA檢測血清IL-35含量采用酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清IL-35水平，IL-35試劑盒購買于上海藍基(BG)公司提供，操作步驟按照說明書進行，檢測儀器為MK3-酶標儀(芬蘭)。

1.4 流式細胞術檢測外周血Treg含量PBMC分離后，將細胞懸浮于含2%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，臺盼藍染色、計數后，采用eBioscience公司的Treg試劑盒檢測外周血調節(jié)性T細胞含量，具體操作步驟按說明書進行。同時采用同型對照管確保抗體特異性染色，抗體標記完后的細胞用FACS CantoII流式細胞儀檢測，用Flow Jo軟件對檢測結果進行分析。

1.5 統計學方法采用Graphpad prism5.0軟件進行統計學分析。計量資料采用均數±標準差(±s)表示，組間差異性檢驗采用t檢驗；計數資料差異性檢驗采用χ2檢驗。采用Pearson相關分析血清IL-35含量與外周血Treg含量的相關性。檢驗水準均為P＜0.05。

2 結果

2.1 血清IL-35含量檢測結果ELISA檢測40例HBV患者和15例健康志愿者(HV組)血清IL-35含量，結果顯示HBV患者血清IL-35的含量[(75.00±6.75)pg/ml]顯著高于健康志愿者血清IL-35含量[(44.13±4.49)pg/ml]，兩者比較差異有統計學意義(t=2.705，P=0.0092)。CSHB組[(89.47±15.75)pg/ml]和CHB-LM組血清IL-35含量[(78.42±8.49)pg/ml]均明顯高于AsC組[(44.83±4.15)pg/ml]，差異均有統計學意義(t=2.258，P=0.036 6；t=2.432，P=0.022 2)；CSHB組和CHB-LM組間血清IL-35含量差異無統計學意義(P＞0.05)；AsC組和HV組間血清IL-35含量差異亦無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 外周血Treg細胞含量檢測結果流式細胞術檢測40例HBV患者和15例健康志愿者外周血Treg細胞含量，結果顯示HBV患者外周血Treg細胞含量[(6.45±0.42)%]顯著高于健康志愿者外周血Treg細胞含量[(3.07±0.31)%]，兩者比較差異有統計學意義(t=4.784，P＜0.000 1)。CSHB組Treg細胞含量[(8.85±0.68)%]明顯高于CHB-LM組[(6.02±0.43)%]和AsC組Treg細胞含量[(3.93±0.49)%]，兩兩比較差異均有統計學意義(t=3.692，P=0.000 9；t=5.310，P＜0.000 1)。CHB-LM組Treg細胞含量明顯高于AsC組Treg細胞含量，兩者比較差異有統計學意義(t= 2.775，P=0.010 1)。AsC組和HV組間外周血Treg細胞含量之間差異亦無統計學意義(P＞0.05)。

2.3 相關性分析Pearson相關性分析顯示，HBV患者血清IL-35含量與外周血Treg細胞含量呈正相關(r=0.340，P=0.031 8)。特別在慢性乙肝重型患者(CSHB)中兩者相關性更為顯著(r=0.822，P＜0.01)。

3 討論

我國攜帶HBV人數占全世界HBV攜帶總數的1/3。乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝病毒，當人體感染HBV病毒后可引起一系列復雜的免疫反應，特別是細胞免疫反應應答紊亂。因此，細胞免疫應答是決定機體HBV感染后轉歸的最重要因素，尤其是CD4+T細胞各亞群平衡的紊亂[2，5]。

Treg細胞作為免疫調節(jié)細胞在HBV感染發(fā)病機制中的作用越來越受到重視，特別是Treg細胞能夠抑制機體過度免疫損傷，但也有利于HBV持續(xù)感染，使機體表現為免疫耐受狀態(tài)[6]。IL-35屬于IL-12家族新成員，是一種免疫抑制性細胞因子，也是Treg細胞主要分泌的幾大免疫抑制性細胞因子(IL-10，TGF-β和IL-35)之一。IL-35由EBl3和p35亞基組成異源二聚體，在抑制效應T細胞增殖、Th17細胞分化和IL-17的合成方面發(fā)揮重要作用。研究證實，IL-35在自身免疫性疾病和感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展中也具有一定的抑制作用[3]。研究還認為Treg在體內可能通過IL-35誘導Treg細胞為iTR35，從而發(fā)揮抗感染作用[7-8]。本研究中，我們發(fā)現HBV患者者外周血中IL-35水平顯著高于健康志愿者，這與國內石銀月等[9]的結果相似。本研究我們還顯示慢性乙肝重型患者血清IL-35和外周血Treg細胞含量尤為增高。值得注意的是，HBV患者血清IL-35含量與外周血Treg細胞含量呈正相關，特別在慢性乙肝重型患者(CSHB)中兩者相關性更為顯著。我們推測，IL-35可能協作Treg細胞參與機體抗感染自身免疫功能的調節(jié)。

目前Th17/Treg細胞平衡關系的研究已是當前HBV疾病進展的研究熱點。有研究認為Th17和Treg細胞可能是由同一個前體細胞分化而來[10-11]。前期研究中我們發(fā)現HBV患者中Th17細胞含量高于健康志愿者[12]，這與國內外多數研究結果相似[2，13]。值得注意的是，我們還發(fā)現分泌IFN-γ的Th17細胞含量在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病階段存在差異，可能在HBV發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，且與慢性乙型肝炎患者病情的進展呈正相關[12]。本研究中我們也發(fā)現HBV患者中Treg細胞含量高于健康志愿者，且與HBV感染的慢性化有關。

總之，血清IL-35和外周血Treg細胞含量在慢性乙型病毒性肝炎不同疾病階段存在差異，可能在HBV發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。HBV感染患者IL-35和Treg細胞亞群的檢測，更能使我們正確、充分、全面地了解慢性HBV的發(fā)病機制和預后，從而更有效地指導臨床治療。

[1]de Franchis R,Hadengue A,Lau G,et al.EASL International Consensus Conference on Hepatitis B.13-14 September,2002 Geneva, Switzerland.Consensus statement(long version)[J].J Hepatol, 2003,39(Suppl 1):3-25.

[2]Su ZJ,Yu XP,Guo RY,et al.Changes in the balance between Treg and Th17 cells in patients with chronic hepatitis B[J].Diagn Microbiol Infect Dis,2013,76(4):437-444.

[3]Olson BM,Sullivan JA,Burlingham WJ.Interleukin 35:A key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance[J]. Front Immunol,2013,18(4):315.

[4]章婷婷,駱春艷,王嘉軍.Th17/Treg失衡在類風濕性關節(jié)炎發(fā)病機制中的研究[J].海南醫(yī)學,2013,24(20):3035-3038.

[5]Li YJ,Wang HL,Li TS.Hepatitis B virus/human immunodeficiency virus coinfection:interaction among human immunodeficiency virus infection,chronic hepatitis B virus infection,and host immunity [J].Chin Med J(Engl),2012,125(13):2371-2377.

[6]張慧,黃麗霞,陳朝霞,等.Foxp3+Treg細胞在HBV感染所致慢加急性肝衰竭中作用[J].東南大學學報(醫(yī)學版),2011, 30(2):315-318.

[7]Collison LW,Chaturvedi V,Henderson AL,et al.IL-35-mediated induction of a potent regulatory T cell population[J].Nat Immunol, 2010,11(12):1093-1101.

[8]Chaturvedi V,Collison LW,Guy CS,et al.Cutting edge:Human regulatory T cells require IL-35 to mediate suppression and infectious tolerance[J].J Immunol,2011,186(12):6661-6666.

[9]石銀月,顏學兵,徐娟,等.慢性HBV感染者外周血中IL-35表達水平的檢測及其意義[J/CD].中華實驗和臨床感染病雜志(電子版),2012,6(3):212-216.

[10]Stockinger B.Good for Goose,but not for Gander:IL-2 interferes with Th17 differentiation[J].Immunity,2007,26(3):278-279.

[11]Laurence A,Tato CM,Davidson TS,et al.Interleukin-2 signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation[J].Immunity, 2007,26(3):371-381.

[12]劉志華,齊青松,張志安,等.慢性乙型肝炎患者外周血CD4+IL-17A+IFN-γ+T細胞的變化及臨床意義[J].熱帶醫(yī)學雜志, 2014,14(3):342-344.

[13]Niu YH,Yin DL,Liu HL,et al.Restoring the Treg cell to Th17 cell ratio may alleviate HBV-related acute-on-chronic liver failure[J]. World Journal of Gastroenterology,2013,19(26):4146-4154.

Changes and significances of IL-35 and Treg cell in patients with chronic hepatitis B virus.

LIU Zhi-hua,QI Qing-song,ZHANG Zhi-an,ZHANG Xiao-jing.Department of Infectious Diseases,Houjie Hospital of Guangdong Medical College,Dongguan 523945,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the changes and clinical significances of serum IL-35 and Treg cell in patients with chronic hepatitis B.MethodsFourty cases in the Department of Infectious Diseases of Houjie Hospital of Guangdong Medical College with HBV patients were categrized into three group:Group AsC(8 patients with asymptomatic HBV carriers),Group CHB-LM(20 patients with chronic hepatitis B with low and moderate),and Group CSHB(12 patients with chronic severe hepatitis B).The Group HV included 15 healthy volunteers.The serum of IL-35 were measured with Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),Treg cell concentration in peripheral blood were determined by Flow cytometry.Pearson correlation analysis was used to analyze the correlation of two independent samples.ResultsHBV patients had a significantly higher the level of IL-35[(75.00±6.75)pg/ml]than healthy volunteers[(44.13±4.49)pg/ml].Significant difference was found between two groups(P＜0.05).The levels of IL-35 both on CSHB and CHB-LM group were significantly higher than AsC group(P＜0.05),but the levels of IL-35 between CSHB and CHB-LM group were no significantly difference(P＞0.05).The Treg cell concentration in the periph-eral blood of HBV patients[(6.4±0.42)%]was significantly higher than healthy volunteers[(3.07±0.31)%],the difference of them were statistically significant(P＜0.05).The Treg cell concentration on CSHB group was significantly higher than CHB-LM or AsC group(P＜0.05).The level of serum IL-35 on HBV patients was positively correlated with the concent of Treg cell in peripheral blood(P＜0.05).ConclusionThe changes of serum IL-35 and Treg cell concentration were difference during different disease phases in chronic hepatitis B,they may play a more important role in the occurrence and worsening process of chronic HBV infection.

Treg cell;Interleukin-35;Hepatitis B,Chronic

R512.6+2

A

1003—6350（2014）11—1638—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.11.0634

2014-01-14)

東莞市醫(yī)療衛(wèi)生一般項目（編號：20131051010006）

劉志華。E-mail：jchengtext@126.com