骨髓間充質干細胞對糖尿病視網膜病變大鼠血糖及視網膜功能影響

利煥廉　周金文　蔡曉華

[摘 要] 目的：探討尾靜脈注射骨髓間充質干細胞對糖尿病視網膜病變大鼠血糖及視網膜功能的影響。方法：48只健康大鼠隨機選取10只為正常對照組，38只建立糖尿病視網膜病變大鼠模型后，20只采用尾靜脈注射間充質干細胞，18只注射等量安慰劑。觀察間充質干細胞在肝、脾、腎、胰腺和眼球的分布以及在視網膜的分化特點，監測注射后1、2、3、4wk血糖變化，觀察血-視網膜屏障破壞修復情況。結果：BMSCS在肝、脾、腎、胰腺、肺等組織中均有分布，視網膜外核層可見到大量密集的BMSCs重疊存在。實驗組大鼠的血糖水平均隨干預時間延長逐漸下降，注射后第1 wk血糖差異即有統計學意義。EB滲漏量較基線明顯減少。結論： BMSCs可降低糖尿病視網膜病變大鼠血糖，使血-視網膜屏障得到一定程度修復。

[關鍵詞] 糖尿病視網膜病變；間充質干細胞； 血糖；血-視網膜屏障

中圖分類號：R774 文獻標識碼：B 文章編號：2055-5200（2014）02-031-04

前 言

糖尿病的眼部并發癥包括糖尿病性視網膜病變（diabetic retinopathy， DR）、白內障、暫時性屈光不正以及出血性青光眼，其中DR作為全世界導致視力缺損和失明的第二大因素，在研究糖尿病眼部并發癥中有重要意義[1]。DR主要臨床表現可分為視網膜缺血缺氧與血管通透性增加兩類。視網膜缺血缺氧[2]又可分為棉絮斑、微血管瘤、新生血管、出血、靜脈管徑變化、視網膜內微血管異常、增殖膜形成。血管通透性增加主要包括滲出與出血。近幾年我國經濟水平增長，糖尿病患者明顯增多。DR會直接導致視網膜的神經細胞、小膠質細胞及膠質細胞等發生病理性改變。視網膜膠質細胞的改變會引起微血管病變，微血管病變又會加重視網膜細胞損傷的程度，兩者相互作用從而形成惡性循環。靜脈和玻璃體腔注射的骨髓間充質干細胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells， BMSCs）可分化為視網膜及血管內皮細胞以穩定新生血管，進而避免發生出血和滲出癥狀[3]。本文通過建立糖尿病視網膜病變大鼠模型，探究骨髓間充質干細胞對DR大鼠血糖及視網膜功能的影響，觀察視網膜中BMSCs表達，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗資料

1.1.1 模型建立及分組 本次實驗進行相關部門審批合格后開展，所有的動物試驗過程均遵循動物試驗規范。實驗所需50只健康的雄性5-7wkWistar大鼠由深圳市人民醫院動物實驗室提供。50只大鼠，體重180g至220g，抽取10只作為正常對照組（A組），其余40只對大鼠進行12 h空腹飼養，之后按60 mg/kg劑量進行腹腔注射2%鏈脈佐霉素（STZ），1 wk后動物血糖水平>16.65mmol/L，尿糖超過3+，糖尿病大鼠模型建立；2只死亡，38只建模成功，模型建立后對大鼠進行觀察，10wk后，抽取DM大鼠及正常大鼠各2只進行視網膜鋪片觀察，比較觀察正常大鼠和DM大鼠微血管形態變化，確定DM大鼠已患有早期DR。

以隨機數字表法將DR大鼠分為2組，B組20只為尾靜脈注射BMSCs組，C組18只為DR對照組注射安慰劑。將大鼠固定在鼠盒內，酒精棉球消毒尾部，1mL注射器抽取0.5mL濃度為1×107BMSCs，勻速推入。對照組予以等量安慰劑尾靜脈注射。

1.1.2 主要試劑 鏈脈佐霉素（STZ）、伊文斯藍（EB）、戊巴比妥鈉（美國sigma公司）；檸檬酸鈉、甲酞胺、40%福爾馬林與檸檬酸（北京化學試劑公司）； 0.9%生理鹽水（北京雙鶴藥業公司）；小鼠抗人核單克隆抗體、小鼠抗Rhodopsin單克隆抗體（美國Chemieon公司）；小鼠抗vWF單克隆抗體、小鼠抗CDgO單克隆抗體（美國AbDSeretee公司）；羅丹明標記山羊抗小鼠Ig抗體、5%羊血清原液（中杉金橋生物技術公司）；PBS粉劑（pH7.2-7.4）（北京中杉金橋生物技術公司）；TritonX-100（美國eBioscienee公司）。

1.1.3 儀器設備 血糖儀、血糖試紙（德國Roche公司）；Syllefgy4酶標儀（美國Bioteek公司）；CO2培養箱（美國NBS公司）；尿糖試紙（廣州珠江生化試劑有限公司）；D70顯微數字成像系統（日本Olympus公司）； SDEI烘箱（重慶四達實驗儀器有限公司）；動靜脈導管、lmL、5mL注射器等均為國產。

1.2 實驗方法

1.2.1 分離培養BMSCs [5] Wistar大鼠（出生5天）進行頸椎脫臼法處死，無菌條件下取出股骨、脛骨及肱骨。以無菌注射器穿刺抽取骨髓5mL，抽取等量含10%FBS之培養基，將骨髓沖出至一個10mL無菌離心管中，混勻后1500轉/分離心5min，棄上清，用L-DMEM重懸細胞，然后過濾成單細胞，置于37°、5%CO2恒溫細胞培養箱進行靜置培養。

1.2.2 組織學處理[6] 大鼠用過量麻醉的方法處死，將其胸腔剖開以暴露心臟，心內灌注25mlL4%多聚甲醛后立即摘除大鼠雙眼眼球，同時取大鼠部分肝、脾、腎、胰腺、肺組織，并將各組織24h浸泡于10%中性甲醛中，后經常規脫水，透明浸臘包埋進行染色及免疫組織化學染色，顯微鏡下觀察。

1.2.3 EB滲漏測定血-視網膜屏障（BRB）功能 10%水合氯醛液0.4mL/kg，腹腔注射麻醉。暴露右頸靜脈，EB45mL/kg由靜脈緩慢注入，觀察眼球、尾巴及四肢變為藍色即認為注射成功。注射后循環120min，之后打開動物胸腔，將預熱至37℃的檸檬酸緩沖液稀釋的1%多聚甲醛由左心室灌注，灌注壓為120mmHg（66mL/min），灌注后，立即摘取眼球，斷頸處死動物。分離視網膜，4°C過夜晾干后稱干重。將視網膜與150mL甲酰胺在70℃下孵育8 h。然后將提取液移入超濾離心管，離心機4℃6000 r/min高速離心90min。取上清液120mL用酶標儀測其吸光度值，測定620nm和740nm2種波長樣品的吸光度值之差（凈吸光度值），建立EB染料濃度在甲酸胺中的標準曲線。每一樣品測量3次.取其平均值。計算各標本中EB濃度，定量計算BRB損傷滲漏情況。

1.2.4 觀察指標 記錄基線及尾靜脈注射后第1、2、3、4wk血糖值。觀察BMSCs在大鼠全身分布情況與其在大鼠視網膜局部的分布。各組伊凡斯藍滲漏量。

1.3 數據與圖像處理

利用SPSS 17.0對數據進行統計，數據采用x±s表示，計量資料采用多組間秩和檢驗，以P<0.05表示差異具有統計學意義。圖像利用Olympus Image-pro Discovery圖像處理軟件進行處理。

2 結果

2.1 BMSCs在全身臟器的分布

尾靜脈注射BMSCs組，注射后第1wk即可發現BMSCS在肝、脾、腎、胰腺、肺等組織中均有分布。角膜及胰腺的部分胰管、胰泡中同樣存在BMSCs。圖1為BMSCs在腎臟和胰腺中分布圖。

2.2 BMSCs在視網膜局部的分布

如圖2所示，尾靜脈注射BMSCs組視網膜外核層可見到大量密集的BMSCs重疊存在著，BMSCs卻很少出現在其視網膜內層及節細胞層。

圖2 BMSCs在視網膜的分布

A： 視網膜外核層中的BMSCs分布，B：視網膜內層的BMSCs分布，C：節細胞層的BMSCs分布

2.3 BMSCs對血糖的影響

A組（健康對照組）大鼠血糖與B組（尾靜脈注射BMSCs組）C組（尾靜脈注射安慰劑組）基線血糖差異顯著。BC兩組大鼠血糖不存在顯著性差異。注射干預血糖水平隨著干預時間的延長呈逐漸下降的趨勢，初始下降較快，1wk后B組血糖與基線值和C組存在顯著性差異。4wk后B組血糖未下降到健康對照組水平。具體數據如表1所示。

BMSCs干預對糖尿病大鼠血糖的影響（x±s，mol/L）

時間 正常對照組

（n=10） 注射BMSCs組

（n=20） 注射安慰劑組

（n=18）

基線 7.0±1.7 23.7±3.9 22.1±2.9

第1wk 6.3±1.8 18.4±2.1* 24.1±3.7

第2wk 7.3±0.9 15.7±2.2# 23.5±2.6

第3wk 6.5±1.4 13.5±3.1 23.0±2.8

第4wk 6.6±1.2 12.6±3.3 22.5±3.1

注：與注射安慰劑組比較 *p<0.05，#p<0.01

2.4 BMSCs對BRB功能影響

DR模型組基線水平EB滲漏量與正常對照組間差異具有顯著統計學意義。B組注射前基線水平EB滲漏量為19.2±3.1（mL/g.h），注射BMSCs后滲漏量下降為8.6±1.7（mL/g.h），P<0.05，差異具有統計學意義。C組注射前后差異無統計學意義。

3 討論

糖尿病視網膜病變是一種可引起局部視網膜缺氧、血管通透性增加的微血管病變，嚴重影響患者的生活[7]。糖尿病在中國發病率已經高達9.7%，患病人口接近1億。隨著我國糖尿病人的增多，糖尿病視網膜病變患者致盲也呈上升趨勢，糖代謝紊亂是DM患者發生DR的根本原因，DR的發展是一個緩慢的過程。相關研究資料表明，50%以上的糖尿病患者在患病5-10年后會發生視網膜病變，15年后則高達75%-80%。

DR早期病理基礎是BRB破壞。BRB由外屏障和內屏障兩部分組成。外屏障由視網膜色素、上皮細胞間緊密連接和包含大量細胞橋粒的閉鎖小帶構成。內屏障主要由內皮細胞、內皮細胞間的緊密連接及周細胞構成，血管旁的神經膠質細胞（星形細胞和Muller細胞）對其起支撐作用，內皮細胞、周細胞、星型膠質細胞間的相互作用可以使內皮細胞間的緊密連接加強。BRB損傷表現為其通透性增加和緊密連接蛋白變化。Kim等[8]發現DM大鼠視網膜緊密連接蛋白occludin、zo-1明顯低于對照組。

BMSCs是成體干細胞中的研究較活躍的一種，體內體外實驗己證實其具有向心肌細胞、肝細胞、神經細胞和血管內皮細胞等其它組織分化的能力。在眼底研究方面，2002年Otani等[9]和Tomita等[10]發現經靜脈和玻璃體腔注射的干細胞可分化為視網膜及血管內皮細胞，并推測干細胞可能能夠穩定新生血管，從而阻止出血和滲出的發生。本實驗結果顯示尾靜脈注射BMSCs后，其在肝、脾、腎、胰腺、肺等組織中均有分布，視網膜外核層可見到大量密集的BMSCs重疊存在。說明全身性靜脈干預的干細胞能夠通過BRB，在目標組織中達到有效的數量以起到治療作用。BRB在DR早期就會出現損傷，尾靜脈注射方式可使BMSCs到達視網膜，部分修復了DR引起的BRB功能損傷。BMSCs對視網膜血管的修復作用機制可能與分化形成的小膠質細胞的功能有關[11]。MSCs能夠在存在視網膜變性病變的小鼠和大鼠模型中表現出視網膜膠質細胞和光感受器細胞的形態和功能，延長自體光感受器細胞的存活時間[12-13]。

BMSCs誘導下干預組血糖下降約54%，可BMSCs有顯著降低血糖的功效。根據4wk血糖測定的結果可知，對血糖的干預主要是在2wk內完成的。其機理可能是BMSCs可以誘導胰島素、胰高血糖素和生長抑素表達。

大鼠尾靜脈注射BMSCs可以在視網膜目標組織達到一定數量，部分修復DR引起的視網膜功能損傷，并在胰腺肝腎等多器官分布，降低糖尿病患者血糖。

參 考 文 獻

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