DA—2006促進骨髓基質干細胞分化為成骨細胞效果及機制分析

劉志剛　熊敏　曾云　余化龍　何寧

[摘 要] 目的：探討體外培養條件下DA-2006促進骨髓基質干細胞分化為成骨細胞的效果與機制。方法：取兔股骨， 骨髓腔進行沖洗， 采用全骨髓法分離純化培養BMSCs，培養至第3代后，分別利用誘導培養液（組A），添加DA-2006的培養液（組B）以及普通培養液（對照組）培養BMSCs，采用噻唑藍（MTT） 檢測3組骨髓基質干細胞增殖能力， 利用熒光定量PCR技術檢測骨堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OC）、骨橋蛋白（OPN）等成骨性標志基因的表達情況。結果：經過誘導后，組B細胞具有良好的形態，擴增能力迅速。在生長率方面，誘導組B較強于誘導組A，對照組團塊化程度最低。對照組的表達量最低，同時組B的ALP、OC、OPN表達量明顯高于組A（P<0.05）。結論：在含DA-2006的細胞培養液誘導環境下，骨髓基質干細胞的成骨分化強于經典的地塞米松誘導效果，其機制的發揮可能與上調ALP、OC與OPN的表達水平有關。

[關鍵詞] 骨髓基質干細胞；成骨細胞；誘導分化

中圖分類號：R681 文獻標識碼：B 文章編號：2055-5200（2014）02-035-04

前 言

骨髓基質干細胞作為干細胞的一種，具自我更新和多分化潛能，具備成為種子細胞[1-2]的可能，在組織工程發展的熱潮中引起科學工作者關注，但圍繞骨髓干細胞的相關研究尚處于起步階段[3-4]。膠質細胞系源性神經營養因子（GDNF）可以通過跨膜的酪氨酸蛋白激酶受體RET激活細胞內多巴胺（DA）神經信號，從而促進神經細胞存活和分化過程。aDA-2006是本實驗者在實驗中篩選、發現的一種易透過細胞膜、無細胞毒作用、可人工合成的小分子化合物。本實驗具體分析DA-2006促進骨髓基質干細胞分化為成骨細胞的機制，為骨組織工程的臨床應用提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：選擇南京青龍山的3周齡新西蘭大白兔（雄性）。實驗試劑與相關儀器：Trizol（美國Invertrogen公司），SYBR Green（日本Toyobo株式會社），反轉錄試劑盒（日本Toyobo株式會社），0.25% 胰酶（上海生物工程有限公司）、新生牛血清（維森特生物技術有限公司）、細胞孵育箱（賽默飛世爾科技中國有限公司） 、超凈工作臺（浙江安泰醫藥有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 脫頸處死大白兔，在75% 酒精中浸泡25-35min后，在兔脛骨結節0.5-1cm處分別抽取骨髓1.5mL，同時加入等體積的DMEM培養液，將液體移至50mL離心管中，1400rpm/min轉速離心5-10min，吸去上清及脂肪層，然后在離心管中添加10%FBS的DMEM培養液4 mL，進行顛倒混勻20次，按1×106個細胞/cm2的密度，將細胞接種于10cm細胞培養皿中，置于飽和濕度孵箱（37℃、5%CO2）中培養。經48h細胞培養后，換液50%，去除未貼壁細胞、紅細胞等，以后每72h進行一次換液。原代培養9-12d后細胞達80%融合，采用添加0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶進行消化后傳代[2]。

將第2代細胞分3組進行培養，誘導組A采用誘導培養液[4]（普通培養液中添加108mol/L地塞米松，0.01mol/Lβ-甘油磷酸鈉，50mg/L維生素C），誘導組B采用含1?LMDA-2006的普通培養液。對照組采用普通培養液。

1.2.2 檢測方法 （1） PCR檢測標志基因的表達：取傳至第3代BMSCs細胞，吸棄培養液，添加1mL冰浴PBS，利用移液器反復輕微吹打細胞，致細胞脫落，1000rpm/min離心細胞收取，轉至1.7mL離心管，加入1mL Trizol溶液，加入0.2mL氯仿。Vortex混勻，5min室溫靜置，然后11000rmp離心，時間為15min。將上層的水相轉入到1.5mLEP管，添加等體積異丙醇，Vortex混勻，然后放于-20℃冰箱中，過30min后，11000rmp離心，10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗滌RNA沉淀，最后7000rmp離心6min。棄上清，靜置5min。

NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR試劑盒說明書進行。應用Primer Premier 5.0的軟件設計、合成ALP、OC、OPN基因引物（上海博尚生物技術有限公司），其特異性利用融解曲線進行分析驗證。

cDNA表達豐度采用Ct值進行檢測，β-actin的Ct值作為內參。

反轉錄結束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按說明書進行熒光定量PCR。

3步法進行Q-PCR擴增，反應條件如下表1。

表1 Q-PCR擴增條件

溫度（°C） 時間（S） 循環次數

95 10 1

92 15 45

60 20 45

72 35 45

（2）MTT法測生長率：各組細胞， 經胰酶消化后， 進行計數， 以2.5*103/L接種于24 孔板中， 每一孔添加250?L，3組均處于37℃、5%CO2 條件下進行培養，在檢測前，每孔加入4mg/mLMTT25L，繼續培養3h， 吸棄培養液， 每孔添加150?L DMSO，振蕩10min， 利用酶聯免疫檢測儀，在490nm 波長進行檢測各孔吸光光度值，每日檢測3孔， 進行均值計算。

觀察不同組別不同時期細胞的形態學，在3組的第3代傳代細胞繪制生長曲線，進行生長率的判斷與計算。同時觀察不同組別的ALP、OC、OPN基因表達情況。

1.3 統計學處理

采用SPSS軟件進行統計處理。所有數據采用x±s顯示，組間差異比較，用兩樣本的均數t 檢驗，P<0.05為差異具統計學意義。

2 結果

2.1 細胞形態學情況

細胞生長的形態學特點如下：具有良好狀態，具有梭形形狀，且放射狀生長，細胞間貼附緊密，70%細胞沿細胞體的長軸排列有序（見圖1），細胞具有良好的純度。通過0.25%胰蛋白酶消化后，傳代培養的骨髓基質干細胞生長明顯速度增加。但傳至20代左右，生長速度會逐漸減慢，細胞內產生顆粒狀的堆積物。

圖1 傳代第3代骨髓基質干細胞（×100）

2.2 生長率情況

該實驗分為誘導組A，即誘導培養液組，誘導組B，即含DA-2006的培養液組，對照組，即普通培養液組。通過MTT法，在3組的第3代傳代細胞繪制生長曲線（見圖2）

3組實驗進行一周的細胞培養后，3組BMSCs細胞均出現不同程度的團塊化，但誘導組B較強于誘導組A，對照組團塊化程度最低（B組相比于A組，F=0.152，P=0.453），說明組B的誘導能力高于其他兩組，但是無明顯差異。

圖2 骨髓基質干細胞生長曲線圖

2.3 成骨分化標志基因表達情況

標志骨髓基質干細胞的成骨分化的基因有ALP[5]、OC、OPN，這些基因在骨形成中擔當著重要作用。通過熒光定量PCR技術，檢測這3個標志基因在添加有誘導培養液或者含DA-2006的培養液的條件下的表達變化（見圖3）。結果顯示對照組的表達量最低，同時組B的ALP、OC、OPN表達量明顯高于組A（X2=3.621，6.521，4.052，P=0.012，0.000，0.009）。

圖3 骨髓基質干細胞的成骨分化標志基因表達情況

3 討論

當前骨髓基質干細胞已經被實驗證實其作為載體在細胞治療和基因治療方面的價值[6-7]。骨髓基質干細胞相對較容易從骨髓中抽取分離，同時較容易進行體外細胞培養及轉染多種外源基因。因此，骨髓基質干細胞相比HSCs在基因治療方面有更多優勢[8-10]，例如HSCs的分離需求大量的骨髓，并且這些細胞是很難大批量體外培養的。

經典的誘導骨髓基質干細胞分化成成骨細胞的方法包括流式細胞儀分離技術，密度梯度離心法，貼壁篩選法[11-12]。操作較簡單的方法為貼壁篩選法，該法篩選的細胞容易成活。在細胞培養過程中，換液次數減少可以保護骨髓基質干細胞的活力。

多巴胺受體可能作為腫瘤干細胞的生物標志物。將人臍帶間充質干細胞誘導分化為多巴胺能神經元并觀察其中腦源性神經營養因子的表達情況，研究指出，臍帶間充質干細胞經誘導后可向多巴胺能神經元分化，且分化后的細胞可表達腦源性神經營養因子。而對于誘導骨髓基質干細胞分化的方法，目前主要是利用骨形成蛋白或者地塞米松[13]進行誘導，本實驗探討人工合成的小分子化合物DA-2006的誘導作用及其機制。結果顯示3組BMSCs細胞均出現不同程度的團塊化，但誘導組B較強于誘導組A，對照組團塊化程度最低，而且誘導組B的密集程度最高，說明含DA-2006的培養液條件下的骨髓基質干細胞的細胞活性比較強，該結果也驗證了增值與分化的矛盾統一原理[14-15]。

人類的骨質是由成骨細胞進行骨質的累積和破骨細胞進行骨質的降解相平衡的一個完美的平衡過程。近年來科學家發現ALP、OC、OPN參與了腫瘤形成、細胞增殖和分化、病毒防御等幾乎所有的生物學過程，它可能有非常廣泛多樣的生物功能。本文通過熒光定量PCR實驗，檢測骨髓基質干細胞在誘導分化后的相關成骨標志基因的表達變化，可以反應其成骨分化水平，骨堿性磷酸酶（LAP）作為成骨細胞表型的標志物之一[16，17]，可反映成骨細胞的活性和功能狀況，主要應用于小兒佝僂病早期診斷，骨源性堿性磷酸酶從骨質中分泌，當骨頭中鈣鹽沉淀出現不足時，分泌會增多，骨中鈣鹽充足則分泌減少。同時相關研究顯示，在干細胞誘導分化為成骨細胞時，OPN與OC的表達水平顯著上調。本文結果顯示，對照組的表達量最低，同時組B的ALP、OC、OPN表達量明顯高于組A。可能機制在于作為干細胞一種開關的多巴胺能控制成骨中新細胞的形成。如果多巴胺信號被抑制，它們就不能產生新的成骨細胞。

總之，本研究探討了DA-2006對骨髓基質干細胞誘導分化為成骨細胞的作用及分子機制。研究發現在含DA-2006的細胞培養液誘導環境下，骨髓基質干細胞的成骨分化情況較強于經典的地塞米松誘導效果，其機制的發揮可能與上調ALP、OC與OPN的表達水平有關。

參 考 文 獻

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