膠原蛋白/絲素蛋白的理化性質及靜電紡膠原/絲素復合材料在骨組織工程中的應用

張振輝，陳旭義，李曉寅，楊曉青，徐云強

(1天津醫科大學總醫院，天津300052;2武警后勤學院附屬腦科醫院)

骨損傷、骨缺損等由于移植物來源短缺或移植后存在多種不良反應等因素，治療上非常困難，成為骨科領域亟待攻克的難題。目前臨床治療方法主要包括內源性骨修復和外源性骨修復兩種。內源性骨修復仍是骨缺損修復的金標準，一般從身體另一部位取出健康骨后移植到損傷部位，其局限性在于骨源短缺，且往往需要二次手術;外源性骨修復雖克服了骨源短缺的缺點，但存在移植體組織相容性及容易引發感染等問題。骨組織工程學的發展改變了傳統的治療模式，其目的是利用工程學和生命科學的原理和方法再生新的骨組織，以修復和替代病變或缺損骨組織。骨組織工程以種子細胞、支架材料、細胞因子作為三要素來構建三維空間復合體，其中支架材料尤為重要，能提供細胞基質、維持細胞生長并保持其分化功能，提供暫時的力學支撐，從而滿足組織修復和重建的要求［1］。隨單一材料支架缺點的不斷暴露，將兩種或兩種以上材料混紡成復合材料以實現其結構和功能上互補的方法，有望在支架材料研究領域展現創新性和實用性。本文就膠原蛋白/絲素蛋白的理化性質及靜電紡膠原/絲素復合材料在骨組織工程中的應用綜述如下。

1 膠原蛋白/絲素蛋白的理化性質

1.1 膠原蛋白 膠原蛋白是動物結締組織的主要結構成分，不同種類動物來源的膠原具有非常相似的化學和生物學特征。膠原蛋白具有較低的免疫原性、良好的生物相容性及生物可降解性，而且來源廣泛，是應用最早的天然生物材料。骨組織中主要含Ⅰ型膠原和透明質酸，是正常骨組織的主要有機成分。其中Ⅰ型膠原與成骨細胞表面特異性受體α整合素亞單位緊密結合，可促進成骨細胞的黏附、增殖、分化;膠原表面還含有沉積礦物位點，對礦物沉積具有誘導作用。Rammelt等［2］研究發現，Ⅰ型膠原還可提高成骨細胞的成骨能力，刺激骨髓間充質干細胞向成骨細胞轉化。但是以單純膠原蛋白為材料所構建的組織工程支架降解速度較快、機械強度較差，不能滿足種子細胞支架的要求［3］。要克服膠原蛋白作為組織工程支架材料的缺點，除對膠原蛋白本身進行改良及加工外，還需尋找性質互補的天然高分子材料。

1.2 絲素蛋白 絲素蛋白是一種含有人體必需氨基酸的天然蛋白質，具有良好的生物相容性和力學性能，且降解緩慢。絲素蛋白由蠶絲經過脫膠制得，是一種無生理活性的天然高分子纖維蛋白，占蠶絲的70% ～80%，含18種氨基酸，其中甘氨酸(Gly)約占46%、丙氨酸(Ala)約占29%、絲氨酸(Ser)約占12%。絲素蛋白由重鏈(H鏈，相對分子質量350 kD)、輕鏈(L鏈，相對分子質量25.8 kD)及糖蛋白p25(相對分子質量23.55 kD)、3個寡糖鏈組成，其中H鏈和L鏈分別由各自c-末端的二硫鍵連接形成復合體，以1∶1的比例存在;糖蛋白p25以非共價鍵與H鏈和L鏈相連接［4］。另外，絲素蛋白存在SilkⅠ和SilkⅡ兩種不同的構象，Silk I構象包括無規則線團和 α-螺旋，SilkⅡ構象則為反平行 β-折疊［5］。其中SilkⅠ結構不夠穩定，經極性溶劑、熱處理等可轉變成穩定的 SilkⅡ結構［6］。Vepari等［6］與 Altman 等［7］認為絲素蛋白主要優點如下:具有其他天然纖維無法比擬的力學性能和柔性;對水和氧通透性好;可通過相對簡單的處理獲得多種不同的形態;有利于組織細胞長入，體內外均降解緩慢。基于上述優點，多孔絲素蛋白在骨組織工程支架中的應用研究日趨得到發展。

Sofia等［8］通過在絲素纖維上培養造骨細胞、成纖維細胞和骨髓細胞，證實絲素肽鏈中含有促生長因子Arg(R)-G1y(G)-Asp(D)肽，相對于其他人工骨材料更有利于骨細胞的黏附生長;將RGD肽引入絲素蛋白膜表面后能顯著提高材料的骨誘導性［7］。Meinel等［9］首次將絲素蛋白制備成三維多孔支架用于骨組織工程研究，先將人間充質干細胞(hMSC)種植在支架上，然后植入鼠顱骨創傷模型，在5周內能夠觀察到誘導骨形成，說明絲素蛋白能用于骨重建和再生，并且表現出良好的力學穩定性和持久性。骨形態發生蛋白(BMP)是存在于骨基質中的一種酸性蛋白質(最早用于誘導骨再生的因子)，能在體內及體外誘導骨髓基質細胞轉化為成骨細胞和軟骨細胞。Kim等在制備絲素蛋白支架材料過程中加入聚天冬氨酸并暴露在磷酸氫二鈉和氯化鈣中控制磷酸鈣的沉積，其后在這種礦化的蛋白復合材料支架上種植hMSC，體外培養6周后見絲素蛋白多孔支架中磷灰石和BMP-2初始含量及成骨增加，表明預先礦化處理的多孔絲素蛋白支架可用于骨組織工程。研究表明，膠原中加入少量絲素蛋白后其干態下的機械物理性能改善，包括膜的力學性能及抗水性能提高、熱水溶失率降低，對成纖維細胞、皮膚表皮細胞具有較好的黏附性。從生物降解方面來講，絲素蛋白緩慢的降解速度能為細胞提供長久的支持，以更好的匹配組織細胞的生長速度，而且可經過不同的處理方法達到不同的形態和孔隙要求。

2 靜電紡膠原/絲素復合材料及其在骨組織工程中的應用

靜電紡絲(簡稱“電紡”)技術由Fonnhah等在1934年首創，是一種在高壓電場作用下形成超細纖維的聚合物加工技術。以此技術制備的微納米纖維支架具有非常高的比表面積、孔隙率以及相互連通的三維網絡結構。相對于傳統技術，電紡技術制備的支架材料能更好地模擬天然細胞外基質的結構特點并為種子細胞的生長提供好的微環境，在組織再生與修復領域有相當廣闊的應用前景［10］。但電紡技術制備的膠原/絲素纖維膜耐水性仍有不足，在水溶液中有一定溶解性，難以保持其纖維形態，故需在密閉干燥器中用25%戊二醛水溶液蒸汽對其進行交聯。研究［11］證實，交聯后的材料在力學性能、穩定性及細胞黏附性方面均顯著提升。美國塔夫斯大學Li等通過體外實驗發現，靜電紡絲素蛋白纖維支持hMSC的生長及向成骨細胞的分化，且該材料有助于提高骨形成。

骨組織工程材料作為人體支撐結構的替代物，需要有良好的力學性能。理想的組織工程支架材料至少應滿足以下要求:具有良好的生物相容性;與神經再生匹配的降解速度;良好的材料—細胞作用界面(利于細胞的黏附與增殖);適宜的孔隙率和一定的力學強度(以提供種子細胞滲透和新生組織生長繁殖);良好的可塑性(可根據需要加工成適宜的形狀和大小)。目前用作組織工程支架的生物降解材料主要有人工合成的高分子物質(如聚乳酸、聚羥基乙酸以及兩者的共聚物)及天然高分子物質(如膠原蛋白、絲素蛋白、殼聚糖、海藻酸鹽等)［12］，前者具有來源不受限制、可調控降解時間、物理機械性能較好等特點，但存在細胞親和性較差、降解速度慢等問題，且在體內長期存在易引起宿主組織炎癥及腫脹等缺陷;后者具有生物相容性好、毒副作用小、易降解、降解產物易吸收的優勢，在組織工程支架材料的研究中備受青睞。Park等用絲素蛋白制作出納米級三維多孔支架，在支架上種植MC3T3-E1成骨細胞，利用 DNA計數和四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)分析細胞增殖及新陳代謝能力，結果發現細胞生長良好，把支架移植入骨損傷小鼠體內7 d后骨損傷完全恢復。說明絲素蛋白和電紡技術在骨組織工程研究和應用上是有潛力的。

劉和風等［13］構建了絲素—膠原復合物半月板支架，并將體外培養的兔半月板纖維軟骨細胞接種在該支架上，再加入轉化生長因子(TGF)-β行三維立體培養，結果顯示纖維軟骨細胞能良好地貼附于支架孔壁上，提示該支架的細胞相容性良好。

目前，雖然骨組織工程支架材料的研究取得一些進展，但廣泛應用于臨床尚有一定距離。在不斷尋求新型骨支架材料的同時，采用復合手段制備理想骨支架材料可能是一種更加有效的途徑。采用電紡技術制備的膠原/絲素復合材料，其膠原微納米纖維理化性能明顯改善，原因為戊二醛蒸汽的交聯作用增加了蛋白分子間的相互作用，使纖維膜的強度明顯升高;而絲素本身的力學性能也高于膠原，因此兩者復合后強度提高。故在充分結合膠原蛋白的良好生物相容性和絲素蛋白優異機械性能的基礎上，所構建出的膠原/絲素復合材料滿足骨組織工程的支架要求。隨著研究的深入及技術的不斷完善，靜電紡膠原/絲素復合材料有望作為一種新型的骨組織工程支架材料在臨床得以應用。

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