細胞因子拮抗肽的制備、作用機制及應用研究進展

林 璐，葉 輝

(1溫州醫科大學第一臨床學院，浙江溫州325035;2溫州醫科大學基礎醫學院)

細胞因子是由機體免疫細胞、免疫原、絲裂原(或其他刺激劑)及某些非免疫性細胞誘導、合成并分泌的小相對分子質量的可溶性生物活性物質，大多為多肽類或者小分子糖蛋白，在正常機體內含量甚微，主要通過與靶細胞表面特異性受體結合發揮作用［1］。細胞因子既具有介導靶向細胞間信號傳遞、調節機體免疫應答、抗炎癥效應、促進造血、抗病毒感染、抗腫瘤侵蝕等重要生物活性，也與引起休克、過度免疫性疾病、生理變態反應、器官移植排斥反應等病理過程密切相關［2～5］。采用激活或抑制細胞因子或其受體的方法可治療細胞因子參與的疾病如類風濕關節炎(RA)、腦缺血損傷、多種癌癥等［6～9］。傳統的細胞因子抑制劑［10～13］主要包括天然黃酮類化合物、生物堿化合物以及木脂素、萜類等，其缺點是特異性不強、療效差［14］，且缺乏激活效果。拮抗肽是新型的細胞因子抑制劑，主要用于治療細胞因子分泌過多所致疾病，優點是可以特異性匹配不同的細胞因子。現將細胞因子拮抗肽的制備、作用機理及應用研究進展綜述如下。

1 細胞因子拮抗肽的制備

拮抗肽的制備方法因其性質不同而異。對于許多天然拮抗肽，其分子構成并不重要，重點在于體外的人工合成(逆向合成技術使用等)或者構建新的表達體系;對于特定序列的肽鏈分子或其他小分子則可以利用已有的多肽文庫進行細胞因子匹配篩選等。隨計算機模擬技術的發展，目前對于拮抗肽的定向設計和理性改造漸趨豐富。

1.1 構建多肽文庫進行特異性匹配篩選 利用小分子短肽模擬細胞因子或受體分子因具有合成簡單、較易形成高濃度工作區、抗原性毒副作用少等優點，已用于許多細胞因子免疫性疾病中。構建一個小分子多肽文庫就是在篩選合適拮抗肽的基礎上，利用“釣餌”(細胞因子，受體蛋白，信號傳遞物質等)精確匹配出肽鏈序列以供后續合成。噬菌體肽庫是最常用的多肽文庫，即將編碼小分子肽鏈的外源基因插入到絲狀噬菌體基因Ⅲ(gⅢ)或Ⅶ(gⅦ)，以使目標肽鏈能以融合蛋白形式連接在噬菌體分泌的PⅢ或PⅧ的N端，進而展示在噬菌體顆粒表面，同時多肽的表達不干擾和影響噬菌體正常生活周期。2014 年 Yoshimoto等［15］與 Zheng 等［16］報道了以表皮生長因子(EGF)模擬肽的一級序列為基礎，結合其生理功能替換13、15、16、41、43和47位氨基酸殘基并將其誘變篩選構建突變噬菌體肽庫，以靶細胞為“釣餌”匹配合成高親和力的激動劑。也可用多個功能分子篩選目的片段以獲得最佳效果，如血管內皮生長因子(VEGF)能與激酶受體結合誘導血管生成并介導腫瘤血管增生，因此對其激酶插入區受體(KDR)的阻斷尤為重要。Binetruy-Tournaire等［17］分別用在細胞膜上表達的KDR和抗-VEGF的中和性單抗篩選噬菌體肽庫，獲得了拮抗性較高的短肽序列ATWLPPR，且順利通過體外實驗與動物實驗。因此，對于小分子拮抗肽的肽庫篩選可非常靈活的依照需求設計方案、分析功能并完成驗證。另外，還有細菌表達肽庫、核糖體肽庫甚至化學合成肽庫等也在研究領域中有較大的應用前景。

1.2 建模分析、理性設計 根據細胞因子或受體構象，模擬生理環境下的相互作用可以正確設計功能位點和輔助鏈，達到事半功倍的效果。如在TNF-α拮抗肽研究中，有學者基于鼠抗TNF-α中單抗Z-12能特異性識別TNF-α的141-146這一功能表位的特點，利用計算機理論模擬構建了TNF/抗體的復合生理反應模型，獲得功能性拮抗肽(PT2、PT3、PT4、PT7);利用人體抗體可變區重鏈框架(VHS)表達拮抗肽(PT2、PT3、PT4)設計了目標單抗，并合成了活性顯著增加的單域抗體(PTVH5)。虛擬篩選庫的應用減少了研究成本，也利于篩選出最優的匹配結構。在肝癌轉移抑制拮抗肽的發展中，有研究者通過分子動力學模擬配體三維晶體結構，并運用分子對接與能量分析系統軟件進行HAbl8G/CD147胞外區受體與對肝癌細胞轉移有高效抑制功能的12肽配體對接，將成果順序經過預打分排序、結合自由能函數經驗性打分排序和結果的成簇處理等階段，最終獲得最優對接結構。通過對最優對接結構理論分析計算，得出受體和配體結合后復合物的結合區域與作用活性位點的詳細相互作用，是今后高效拮抗肽研究發展的方向。

1.3 體外表達體系構建 在普通方法獲得的目標產物數量不足以滿足研究需求時，就需要運用合成生物學手段人工構建體外產物表達體系。另外，許多細胞因子在生物體內即有天然的拮抗劑或可溶性受體，此類拮抗肽可直接從機體分離獲取，但技術繁瑣、效率不高且花費較大。隨基因工程標準化、模塊化的發展，各種工程菌株以及分子生物學操作工具的完善，構建高效穩定的表達體系變得十分便捷。表達體系的構建通常是在前述兩種手段的基礎上進行的。如用于緩解強直性脊柱炎(AS)癥狀的拮抗肽基于阻斷HLA-B27信號途徑的治療性基因疫苗［18］，研究人員在前期工作中使用 HLA-B*2704及HLA-B*2705重鏈胞外區蛋白篩選噬菌體12肽隨機肽庫并獲得了能與其特異性結合的拮抗肽，然后針對HLA-B*2705-AP進行pcDNA3.1真核表達載體的構建及后續表達鑒定，構建了融合有增強型綠色熒光蛋白編碼基因的 pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合CHO細胞表達載體和pcDNA3.1/HLA-B*2705-AP-EGFP的融合 CHO細胞表達載體，為深入研究和臨床應用打下基礎。此外，在B細胞活化因子(BAFF)拮抗肽研究中，研究人員在前期工作中先以跨膜激活劑及鈣調親環素配體相互作用分子(TACI)和BAFF的3D結構為基礎設計目標拮抗肽，然后以pET-30a-BAFF1為基本表達載體，利用不同的內切酶和引物克隆獲得一個高效的重組表達載體——pET-30a-BAFF2，在相同誘導表達和純化條件下獲得可溶性的BAFF1、BAFF2蛋白，并在體外親和性測試中獲得較好效果。體外表達體系構建的另一個重要作用就是為拮抗肽的大規模生產提供可能，即利用微生物生長周期短、繁殖迅速的特點提高產量、降低成本，而如何保持重組體系的高效穩定則是需要迫切解決的問題。

2 細胞因子拮抗肽的作用機理

2.1 拮抗肽與靶細胞表面受體特異性結合 拮抗肽發揮功能的關鍵主要在于其特殊的肽鏈及高級空間結構，可通過促進拮抗肽與靶細胞的受體特異性結合而競爭性或非競爭性抑制細胞因子與受體的結合。研究者將多肽類抗腫瘤擴散抑制劑與細胞表面的整合素、層粘連蛋白(LN)和纖維粘連蛋白(FN)的結合位點結合，通過飽和上述位點可抑制細胞因子所致腫瘤黏附、浸潤和轉移(RGD短肽)，抑制腫瘤細胞黏附到內皮細胞并降低腫瘤細胞的侵襲能力(GRGDS短肽)。設計合成拮抗肽過程中，其與受體細胞的親和能力是最重要的因素。錢鈺等［19］認為，TNF拮抗治療中細胞因子介導的信號通路涉及物理作用、磷酸化、泛素化、酶復合作用等多個過程，構建拮抗肽時需要選擇特定的化學基團(氨基酸基團、殘基)提高與靶向目標(可以是中間信號分子)的親和能力、更好的阻斷信號通路。在噬菌體肽庫的短肽鏈篩選上，也需要從靶細胞出發選擇結合性能最好的拮抗肽。

2.2 拮抗肽模擬受體元件與細胞因子結合 除與細胞受體特異性結合外，部分小分子拮抗肽尚可模擬細胞靶受體的功能元件與細胞因子結合進而阻止細胞因子與靶受體的結合，抑制相應信號通路的傳遞。Gevaert等［20］研究發現，IL-5的某種拮抗肽具有與其相似的二硫鍵交聯結構，可模擬結合位點而阻斷原信號通路。Bourboulia等［21］發現，CD147拮抗肽(HAb18G等)可在高位阻斷細胞因子的分泌進而抑制其促基質金屬蛋白酶(MMPs)生成作用，最終抑制腫瘤擴散。陳麗娜等發現，在細胞內有一種TNF的天然小分子模擬肽拮抗劑，其產生于跨膜運輸后的酶切脫落或mRNA剪切異常，可作為負調節因子將細胞因子轉運至各種組織細胞釋放(或者延緩釋放)，從而阻斷細胞因子與細胞靶受體的結合，抑制信號通路的發生。此類拮抗肽的特點為天然無抗原性、無排異性。

2.3 大分子拮抗肽的抑制作用 錢鈺等［19］發現，某些大分子拮抗肽可通過氨基酸殘基的直接酸堿中和作用或底物磷酸化某些信號分子等宏觀反應抑制細胞因子。王聰等［22］研究表明，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的拮抗肽P7與bFGF結合后，bFGF激活的促增殖信號分子磷酸化水平降低、細胞增殖作用受抑。此類拮抗肽相對分子質量較大，關鍵結構是一些有快速反應能力的氨基酸殘基或其功能基團，可通過分離機體組織液獲取。Gautier等［23］通過核磁共振(NMR)和細胞試驗發現，VEGF的拮抗肽化合物能抑制VEGF165誘導的VEGFR-1磷酸化，有望作為新的抗血管生成劑用于臨床。

拮抗肽的作用機理與肽鏈的一級乃至二、三、四級空間結構密切相關。選擇合適的靶點目標及利用結構解析深化作用機理研究相互構效的關系，有望實現功能肽鏈的不斷改進。

3 細胞因子拮抗肽在臨床上的應用

3.1 TNF-α拮抗肽 TNF-α是細菌性膿毒血癥病理機制中的關鍵介質，其過量表達在RA、感染性休克及其他多種炎癥反應過程中均具有損傷性、甚至致死性。早期研究［24］顯示，細胞因子在RA發病中具有一定作用，且患者關節滑液中可檢測到IL-1、TNF、IL-6、IL-2、粒細胞集落刺激生物因子(GMCSF)等主要炎性細胞因子。另有學者［25，26］報道，利用匹配篩選出的高親和力特異性單克隆抗體可以較好的中和人TNF等因子(包括A2抗體、降低免疫原性后的cA2嵌合型抗體)，從而較好的控制TNF異常表達誘發的疾病。歐洲四個地區的雙盲、隨機、安慰劑對照試驗顯示，應用1、10 mg/kg的cA2后兩組有效率分別為44%、79%，之后的二期臨床進一步篩選了用量及周期［24］。

3.2 IL拮抗肽 IL-1α、IL-β 都屬于重要的 IL，在炎癥反應中起調節劑的作用，其大量產生會引起下列內分泌效應:誘導肝臟急性期蛋白合成;引起發熱和惡病質。通常機體能夠通過自身分泌受體拮抗肽IL-1ra調節IL-1r的結合通量和活性。Akeson等［27］利用人工重組可溶性IL-1受體篩選15肽噬菌體肽庫，得到的特異性短肽鏈活性接近天然IL-1ra;進一步設計構建得到15肽鏈AF12198，在機體內外均可抑制多種IL-1誘導的生物學活性。IL-5通常由抗原活化的CD+4T細胞產生，主要功能是刺激嗜酸性粒細胞增殖、分化及活化。在過敏性疾病和蠕蟲感染時機體出現的嗜酸性粒細胞驟增也主要經由IL-5引起，特別是人類體內的IL-5還能刺激嗜堿性粒細胞釋放白三烯和組胺等炎癥介質，提高嗜堿性粒細胞的生理活性。England等［28］進行隨機肽庫篩選時發現，將人體IL-5 Ra胞外區(ECD)作為靶點可以匹配到兩種能與之特異性結合的小分子肽，其后創立變構肽庫時通過親和性篩選獲得具有拮抗IL-5功能的19肽AF18748，而嗜酸粒細胞黏附試驗顯示目標肽鏈可高效拮抗IL-5的生理活性。

3.3 BAFF拮抗肽 BAFF屬于腫瘤壞死因子配體超家族(TNSF)，其功能主要是刺激B細胞增殖、分化和成熟并維持其生理活性，在體液免疫應答過程中具有不可替代的作用。正常機體環境中，TACI、B細胞成熟抗原(BCMA)、BR3三個自身受體可與BAFF特異性結合，進而調節B細胞生理活性并維持機體免疫應答平衡。BAFF分泌不足會引起機體免疫功能紊亂、低下，造成免疫缺陷類疾病;BAFF表達過度則會誘發B細胞的惡性增殖、引起B細胞介導的自身免疫反應性疾病如RA、干燥綜合征(SS)、系統性紅斑狼瘡(SLE)和 B淋巴細胞瘤等［29］。Kayagaki等［30］研究表明，以 BR3 和 BCMA為基本構象的拮抗肽可高效抑制BAFF的生理功能，而利用BAFF及短肽鏈的3D結構分析可以定向設計、構建具有拮抗功能的拮抗肽，并可通過體外實驗驗證其用于臨床治療的可行性。研究者在TACI關鍵氨基酸殘基的基礎上自行設計并合成得到兩種拮抗肽TA和TC，其抑制率隨肽濃度增大而顯著增高，拮抗肽質量濃度為100 μg/mL時對目標BAFF的抑制率分別達31%和51%，有著良好應用前景。

3.4 癥狀緩解類拮抗肽 部分免疫類疾病致病機理復雜，但引發癥狀較嚴重。如強直性脊柱炎(AS)發病早期隱匿性高、致病過程長，最終導致患者正常活動能力喪失。能高效、低毒迅速緩解AS的癥狀，又能選擇性有效阻斷AS病理過程的治療方法是目前所推崇的。Santos等［31］研究表明，HLA-B27是AS發病免疫過程的中心環節;有學者將HLA-B*2704及HLA-B*2705重鏈胞外區蛋白作為釣餌篩選噬菌體12肽隨機肽庫，獲得了能與其特異性結合的小分子拮抗肽，以此為基礎加工構建了具有治療功效的拮抗肽分子，并在體外功能鑒定中獲得較好效果。

以上幾種是較為典型的細胞因子拮抗肽在臨床醫療或實驗階段的應用，都表現出高效、特異的優點，隨著拮抗肽作用機理研究的深化以及拮抗肽合成方式的優化，這種治療方法有望得到更大規模的推廣。

細胞因子造成的免疫類疾病長期以來給人們的健康造成了非常大的危害，而拮抗肽是可以特異性治療此類疾病的藥物，對其功效以及機理的研究有著非常大的實用價值。目前已經研發了可有效控制RA、癌細胞擴散及AS的多種拮抗肽類制劑，對其機理的研究也已經從功能作用深入到分子結構及空間構效上，故其擴大應用的前景十分可觀。今后的研究需要掌握拮抗肽對機體穩態系統的影響，在分子水平更深入解析不同部位的作用及整體構象的影響，在合成方法和工藝上需要從天然獲取角度開發新的思路。

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