細胞自噬與肝臟疾病

郭海清，陳亞利，段鐘平，任 鋒，張 晶

(首都醫科大學附屬北京佑安醫院，北京100069)

自噬又稱細胞的自體溶解，是指隔離膜包裹胞質蛋白和細胞器形成自噬體，然后與溶酶體融合成自噬溶酶體并在其中降解的過程。自噬現象普遍存在于大部分真核細胞中，通過對細胞內變性蛋白或受損細胞器進行降解，以維持細胞內物質循環及代謝調節的穩定，在細胞生長、分化、功能執行、自我更新、衰老及死亡中發揮著重要調控功能。近期有大量研究報道，自噬與肝臟疾病的發生、發展及預后存在相關性。本文就自噬發生、演變中的分子機制及其與臨床常見肝臟疾病的關系作一綜述。

1 自噬的發生、演變過程及分子機制

根據降解物進入溶酶體方式的不同，細胞自噬大體分為3類，即微自噬、分子伴侶介導的自噬和大自噬。大自噬即通常所說的自噬，部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分被非溶酶體來源的雙層膜結構包裹形成自噬體，最后與溶酶體形成自噬溶酶體，并在其中降解的過程。除此之外，還有非典型性自噬和新近報道的RNA自噬［1］。

自噬在生理狀態下維持細胞的營養、細胞器的動態平衡，自噬參與線粒體質量控制過程［2］;在各種應激情況下，如氨基酸等營養物質耗竭、缺血缺氧再灌注損傷或病原微生物入侵等，自噬作為機體的一種適應性反應出現。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)被認為是細胞內能量和營養狀態的感受器［3］，營養豐富時，mTOR可磷酸化自噬相關基因(Atg)13，高磷酸化的Atg13與Atg1結合減弱，使Atg1激酶活性下降，抑制自噬下游信號;在饑餓狀態下，mTOR的活性被抑制，Atg13去磷酸化，從而與Atg1激酶緊密結合，使Atg1激酶活性增強，誘導自噬的下游信號。除mTOR通路外，還存在非依賴mTOR的自噬途徑［4］，某些氨基酸通過此途徑抑制自噬。最新研究表明，mTOR上游還可能受到TBC1D7蛋白的調節，其表達下調，mTOR上調，自噬信號延遲，有利于細胞生長［5］。自噬體的形成和發育成熟是自噬過程的核心機制，也是近年來自噬領域研究的熱點之一。有學者認為，線粒體、高爾基體、核糖體膜，甚至細胞膜都參與了自噬體雙層膜的形成過程［6］。多種自噬相關基因參與了自噬的調控過程，如Atg5、LC3和Beclin 1等。在哺乳動物細胞中，Atg12、Atg5、Atg16以復合物形式存在，形成前自噬體，存在于胞質中;在自噬泡膜的延伸過程中，一部分Atg12-Atg5-Atg16復合物定位于膜表面，待自噬體雙層膜結構形成后，此復合物便從膜上解離下來，自噬體發育成熟。LC3是酵母自噬基因Atg8在哺乳動物中的同源物，自噬發生時，胞質可溶性形式的LC3-Ⅰ轉換為定位于前自噬體和自噬體的LC3-Ⅱ，成為自噬體的標志分子。ClassⅢPI3K與Beclin 1形成復合物參與自噬體的形成。近期有研究表明，自噬的發生可以不依賴Beclin 1和ClassⅢPI3K而存在，稱為非典型性自噬。自噬功能的完整性依賴于自噬體與溶酶體的融合，有日本學者認為，存在于成熟自噬體外膜的突觸融合蛋白17介導了這種融合［7］。大分子在溶酶體/囊泡內降解成小分子單元(如氨基酸等)，然后轉運到胞質被重新利用。

2 自噬與常見肝臟疾病

2.1 自噬與病毒性肝炎 體外肝細胞系和轉基因小鼠的研究表明，HBV可誘導肝細胞發生自噬［8］。HBV可以增強自噬并利用自噬增強DNA的復制［9］。Tian等［10］在轉基因小鼠肝臟中特異性敲除Atg5，用免疫印跡法證實了其自噬受到抑制，同時觀測到血清中HBV DNA載量下降、HBeAg和HBsAg血清水平下降，HBV C基因和S基因的RNA水準下降。進一步研究發現，在野生型小鼠肝細胞內，HBV核心蛋白主要位于胞核，只有少量分布于胞質，而在基因敲除小鼠體內則從胞核彌散到胞質。自噬影響了HBV核心蛋白的定位，這對于HBV在體內復制非常重要，并可能成為治療HBV潛在的靶向途徑。HBx是HBV編碼蛋白，其表達可以誘導自噬，此在轉基因小鼠體內的研究得到類似結果。新近研究表明，丙型肝炎病毒(HCV)非結構蛋白可以誘導自噬并作為自身抗損傷的保護性機制［11］。HCV感染后上調Beclin 1基因，與ClassⅢ PI3K形成復合物，是細胞發生自噬的始動因素。此外，在自噬與HCV感染患者糖代謝關系的研究中發現，HCV感染通過擾亂糖平衡或胰島素信號轉導誘發胰島素抵抗，而自噬參與了這個過程［12］。

2.2 自噬與急性肝損傷 刀豆蛋白A(ConA)和脂多糖/D-氨基半乳糖誘導的急性肝損傷模型最為常用，小鼠肝細胞自噬程度在兩個模型中都表現為增強。但是，ConA誘導的急性肝損傷中，肝細胞和肝臟血管上皮細胞發生自噬性死亡，而脂多糖/D-氨基半乳糖胺誘導的急性肝損傷中，自噬對肝細胞表現出保護作用［13］。在肝癌細胞株中，IFN-γ通過增加溶酶體膜通透性，釋放組織蛋白酶B和L來增強ConA誘導的自噬性肝細胞死亡［14］。孕烷X受體(PXR)是核轉錄因子受體，可以調節藥物代謝酶和轉運外源性毒物而解毒。在野生型和PXR缺陷型小鼠中，用脂多糖/D-氨基半乳糖誘導急性肝損傷，PXR缺陷型小鼠在丙氨酸轉氨酶(ALT)升高、肝細胞凋亡、壞死及出血性肝損傷程度方面均比野生型小鼠更為嚴重，提示 PXR是一個關鍵的保肝因素［15］。現有的研究結果表明，在急性肝損傷中，細胞發生自噬以使其在應激狀況下存活，如果應激過強或應激時間過長，細胞則發生自噬性死亡。

2.3 自噬與酒精性肝臟疾病 急性酒精性肝損傷時肝細胞通過增強自噬來減輕乙醇毒性［16］。有研究報道，小鼠快速乙醇灌胃后，通過抑制mTOR信號通路來增強自噬。慢性長期飲酒可導致脂肪肝、肝纖維化、肝硬化和酒精性肝炎等疾病。乙醇暴露能夠增加肝細胞自噬體形成，但抑制溶酶體功能，所以長期飲酒可以抑制肝細胞發生自噬，其機制尚不清楚，目前有兩種可能的機制［17，18］:①乙醇能夠顯著降低腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)在肝臟中的活性，AMPK通過mTOR抑制自噬;②自噬過程需要細胞骨架蛋白如微管和微絲的參與，二者在自噬小體的形成和融合中具有重要的作作用，乙醇可以阻斷二者在細胞內的運動，抑制自噬。長期攝入酒精后自噬下降，肝臟會發生一系列病理改變，如肝細胞內蛋白分解代謝減緩，Mallory-Denk小體形成，肝細胞氧化應激、脂質聚集，轉氨酶升高等。另有研究表明，長期過量飲酒能夠協同HCV加重肝臟損傷，HCV患者長期飲酒與不飲酒相比，感染病程更長且慢性肝炎的臨床癥狀更嚴重［19］。

2.4 自噬與非酒精性脂肪性肝臟疾病 除脂肪酶途徑外，脂肪發生自噬是調節細胞內脂質平衡的另一個重要途徑。脂質進入自噬體后被運送到溶酶體，降解為脂肪酸。脂肪自噬水平隨營養狀況不同而有所改變。有研究證實，短期內脂質增加，自噬水平增強，從而使過多脂質分解，為β-氧化或其他途徑提供脂肪酸［20］。相反，在慢性肥胖和胰島素抵抗的小鼠模型中，持續性脂質上升導致肝細胞自噬水平降低，其原因可能是在生理條件下基礎自噬也參與了脂質代謝，通過胰島素—氨基酸-mTOR途徑抑制自噬。Lin等［21］研究發現，自噬抑制劑氯喹增加了肝脂肪變或肝損傷，但卡馬西平能減輕這種損傷。在高脂飲食誘導的非酒精性肝脂肪變中，卡馬西平和雷帕霉素在減少肝臟脂肪變性中具有保護作用，說明使用藥物調整自噬水平可能成為減少肝臟脂肪變性和肝損傷的一個有效策略。通過研究22例HCV感染者的肝活檢標本發現，自噬參與了HCV患者肝脂肪變的發展過程［22］，脂肪變中脂質囊泡和自噬水平呈負相關，自噬體與脂質沉積(主要為未酯化的膽固醇)發生共沉淀，抑制自噬發生。

2.5 自噬與藥物性肝損傷 肝臟是機體中最重要的代謝和解毒器官，藥物進入體內后主要經肝臟代謝，因此肝臟極易受藥物損傷。在美國，超過50%的急性肝衰竭是由藥物引起的。對乙酰氨基酚(APAP)因其解熱鎮痛作用而被廣泛應用，其治療劑量是安全的，但食用過量會對肝臟造成嚴重損害。APAP過量時可引起線粒體損傷，導致肝細胞凋亡或壞死，使動物或人類肝臟功能受損。研究表明，在APAP誘導的肝功能受損的小鼠體內，使用雷帕霉素誘導自噬可以減輕肝臟損傷，用氯喹或3-甲基腺嘌呤抑制自噬則加重肝臟損傷。自噬可以清除受損線粒體，減輕APAP引起的肝細胞凋亡或壞死，但雷帕霉素并不影響APAP的代謝，說明其保護作用的位點可能位于APAP代謝的下游區域，并可能是通過線粒體自噬實現的［23］。最新研究表明，在ATG7基因敲除的小鼠中，由于自噬缺陷，APAP使ROS產生增加、線粒體膜去極化和肝細胞中JNK活化，引起嚴重的肝損傷［24］。環孢素A或 JNK抑制劑與APAP聯合使用能夠減輕自噬缺陷肝細胞的凋亡和壞死。依非韋倫(EFV)是治療HIV最為常用的非核苷酸逆轉錄酶抑制劑，雖然其作用機制尚未闡明，但有研究發現它可以通過誘發線粒體功能障礙而引起肝毒性。EFV激發線粒體自噬，自噬囊泡增多、自噬相關蛋白LC3和Beclin 1表達增多。適量濃度的EFV可以誘導自噬，但濃度過高會抑制自噬，使肝細胞增生和凋亡減慢，加重肝損傷。

2.6 自噬與自身免疫性肝臟疾病 原發性膽汁性肝硬化(PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝臟疾病，其特征為血清學上的抗線粒體抗體(AMAs)陽性和組織學上的小膽管炎，伴隨小膽管的廣泛損傷。PBC的病因和發病機制尚不明確，有研究表明，細胞自噬可通過MHC-Ⅱ類分子遞呈胞質抗原和調節T淋巴細胞動態平衡參與到PBC小膽管的損傷過程中［25］。PBC小膽管損傷過程中，自噬特異性上調，在PBC受損的小膽管細胞胞質中，LC3特異性表達。PBC早期，細胞受損信號激活先天性免疫反應，伴隨肉芽腫形成、嗜酸性粒細胞反應和IgM升高。在應激的膽管上皮細胞中，異常的線粒體自噬啟動針對線粒體抗原的免疫應答。線粒體自噬、細胞凋亡和膽管增生限制膽管內的炎癥反應。在PBC中，自身抗體反應的靶向為Bcl-2家族的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，或者是腎上腺素能或膽堿能系統的受體，以此干擾膽管上皮細胞的凋亡和增殖程序［26］。有學者認為，膽管上皮細胞衰老、微環境發生改變也參與到PBC的病理生理過程中。

近幾年自噬在分子生物學領域取得了迅猛發展，對自噬的認識已由最初的細胞水平進入亞細胞、分子基因水平。細胞自噬在機體調節中具有雙重作用，既是細胞應激條件下的生存機制，也可以在一定的條件下誘導細胞發生自噬性死亡。研究肝細胞自噬信號轉導中各種分子交聯及尋找新的肝病治療靶點，具有重要的理論意義和潛在的臨床應用價值。

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