RNA干擾治療技術的應用研究

錢 江，傅仲學

(1重慶市墊江縣中醫院，重慶408300;2重慶醫科大學附屬一院)

RNA干擾(RNAi)是20世紀90年代發現的一種在進化過程中具有保守作用的特異性序列，是由dsRNA介導的、存在于動物和植物中的轉錄后基因沉默現象，最先在矮牽牛屬植物中發現［1］。一些體外和體內研究表明，絕大多數疾病是由于部分基因的遺傳損傷或過度表達所致，因此這部分基因成為以RNAi技術為基礎的臨床治療方法的潛在目標［2］。動物模型研究表明，以RNAi技術為基礎的藥物可以有效地治療各種疾病［3］。目前正在開發用于治療年齡相關性黃斑變性的RNAi療法，只需直接噴射含有血管內皮生長因子(VEGF)的特異性短干擾RNA(siRNA)進入玻璃體腔內，從而有效地將siRNA注射入眼球中。運用RNAi療法可直接將siRNA注入肺組織內治療呼吸道合胞病毒感染而引起的肺炎。然而，以RNAi技術為基礎治療其他疾病，特別是在治療腫瘤方面的開發和利用以及將siRNA轉導至靶組織中的研究和開發工作更有重要意義。

1 RNAi療法治療腫瘤

腫瘤是RNAi基礎治療的主要目標之一，腫瘤基因、腫瘤抑制基因的突變和其他促進腫瘤發展的基因都可以成為RNAi基因沉默技術應用的重要潛在目標。由于作用機制確切、高特異性和高效率，RNAi介導的基因沉默可以減少與化療藥物密切相關的不良反應。RNAi主要優勢是可以同時針對腫瘤進展中涉及不同細胞途徑的多個基因進行治療，可以將以小分子為基礎治療腫瘤產生多藥耐藥性的概率降到最低。以RNAi技術為基礎療法的另一個優點是可以開發適用于特定患者的個性化抗癌藥物，這種個性化的藥物可以更有效地控制腫瘤，從而提高藥物治療腫瘤的成功率。CALAA-01是轉鐵蛋白靶受體，是用納米封裝的非化學修飾的siRNA特定的核糖核苷酸還原酶 M2亞基(RRM2)，參與DNA的復制。CALAA-01結合轉鐵蛋白受體和釋放含有RRM2特異性的siRNA通過細胞內吞作用后，抑制RRM2基因的表達，從而防止轉鐵蛋白受體在腫瘤細胞中的增殖。已有醫藥公司進行了針對實體瘤患者的全身用藥的CALAA-01的Ⅰ期臨床試驗［4］，從黑色素瘤患者治療后的腫瘤活組織切片檢查顯示細胞內的局部有納米粒子的存在，并在基因和蛋白水平降低RRM2的表達。Ⅰ期臨床實驗表明，CALAA-01的siRNA患者的全身給藥，可以沉默腫瘤細胞中的與腫瘤相關的基因［4］。

2 siRNA治療的藥代動力學策略

目前，研究者所面臨的主要問題是以siRNA為基礎治療腫瘤和其他疾病時如何提供針對siRNA的體內靶細胞群。以siRNA為基礎的抗腫瘤藥物的療效，取決于強而有效的腫瘤細胞基因沉默，實現有效的體內基因敲除需要將siRNA送至靶組織。siRNA分子的高負電荷使其在體內的吸收效率降低;而且核內體的siRNA降解與快速清除是經血液通過腎臟排泄的，因此siRNA通過靜脈途徑進入體內后，其效力也將大大降低。為了實現有效的siRNA傳遞與基因沉默治療，需要一個理想的藥物遞送系統保護siRNA不受核酸酶的降解，并提高其穩定性，防止非靶組織的非特異性攝取，并提高治療靶細胞和組織攝取siRNA［5］。對于局部攝取，未修飾的siRNA可以簡單的配方(如生理鹽水)局部應用在各種組織中包括呼吸道上皮細胞、眼和中樞神經系統引起明顯的基因沉默效果［6］。全身用藥時，siRNA的傳送面臨巨大挑戰。未加任何藥物生理鹽水配制的siRNA靜脈注射后在血清由核酸酶降解，并經腎臟快速排泄出體外。因此，如果嘗試全身siRNA用藥，需要提高siRNA血清半衰期，使其能分布到靶組織，在其靶細胞的胞質內釋放，才不會降低隨后的攝取，并避免脫靶基因沉默活性的降低。

為提高基因沉默活性的效率，siRNA的化學修飾必不可少，因為這些修飾的siRNA可保持其在血清中的穩定性［7～9］。一個理想的修飾應加強siRNA的穩定性，而不會影響其基因沉默活性。siRNA在核糖環的2’位置上的修飾已被證明可以防止核酸內切酶的降解，增加siRNA的穩定性。其他包括在2’-O-甲基、2’-脫氧-2’-氟上的修飾，能提高血清的siRNA的穩定性，并提高其在體內的效力。通過受體介導的內吞作用或通過膜透性的增加，帶負電荷的siRNA與膽固醇的共軛可以增強的siRNA的攝取［10］。Soutschek 等［11］報道，膽固醇共軛的 siRNA的靶向載脂蛋白B，可以增加siRNA在血清中的穩定性和增強其基因沉默活性。據觀察，血清膽固醇載脂蛋白B特異siRNA的共軛與通過靜脈內給藥的未結合的對照組相比，可以使siRNA腎清除率明顯下降，并使血清半衰期增加16倍。更重要的是，膽固醇共軛也促進了受體siRNA介導的肝細胞的攝取，并使小鼠肝臟中60%的載脂蛋白B基因沉默。與膽固醇的共軛siRNA治療方法更加有助于將siRNA傳遞到肝臟，從而形成一種有效的治療肝癌的方法。

siRNA體積小(平均粒徑＜10 nm)，未配制的siRNA可以很容易地從人體排泄，從而出現siRNA的生物利用度降低，藥代動力學特性較差［12］。有研究通過核酸酶提高siRNA的粒徑，并防止其降解，專門設計納米顆粒較大(50～200 nm)的siRNA以抑制小鼠模型中的腫瘤生長［13］。這些納米粒子，由共軛生物惰性聚合物直接插入siRNA或者制備封裝siRNA的脂質體構成，在血清中較穩定，可提高藥代動力學效能，從而改善這些治療分子的生物利用度。有效地將siRNA傳遞至靶組織，納米粒子的大小非常重要。研究顯示，納米粒子大小從10～200 nm的被視為最優;因為通過受體介導的內吞作用，小到足以穿過細胞膜，大到足以被保留在人體內，從而提高siRNA的治療效果［14］。

3 siRNA靶組織傳遞特異性及安全性

改善siRNA靶組織傳遞特異性，應使有治療作用的siRNA定位在腫瘤細胞，避免定位在正常細胞。目前已經制定了一些促進細胞類型特異性siRNA傳遞的策略，包括抗體，配體及核酸適配體。抗體對特定的抗原具有極高的親和力和選擇性識別能力。抗體片段有眾多的抗原識別域，如識別艾滋病毒包膜糖蛋白的一個高度帶正電的魚精蛋白能成功傳遞siRNA的靶向HIV序列至病毒感染的CD4+T細胞，從而抑制病毒的復制。此外，靜脈注射抗血管生成的siRNA絡合Fab-魚精蛋白的融合蛋白成功定位至皮下植入的腫瘤細胞，可抑制腫瘤生長［15］。此外，細胞類型特異性傳遞方面也獲得了可用適配體，為高度結構化的核酸分子(RNA和DNA)及與其親和的一個特定目標分子。核酸適配體都是通過幾次綁定到達特定的細胞表面的靶抗原［16］，與單個RNA適配子可以直接連接到以siRNA分子為細胞特定類型產生的嵌合RNA中。與前列腺特異性膜抗原(PSMA)特異性結合的適配體將siRNA傳遞至前列腺癌細胞，抑制前列腺腫瘤在小鼠異種移植模型中的生長已被證明有效［17］。

除了特定目標的siRNA傳遞，siRNA治療的另一問題是意外脫靶效應［18］。以siRNA為基礎療法的傳遞和脫靶效應是聯系在一起的，高效遞送siRNA至靶癌細胞會降低正常細胞的暴露數量，有利于腫瘤細胞吸收siRNA，從而減少了潛在的脫靶效應。此外，siRNA有效傳遞到癌細胞也會減少siRNA治療劑量，從而最大限度地減少與治療劑量相關的不良反應。siRNA治療的另一不良反應是導致大量炎癥性細胞因子(如干擾素-α、腫瘤壞死因子-α和白介素-6)誘導的先天免疫系統的激活，導致免疫功能紊亂。因此，開發以siRNA為基礎的治療技術需慎重。

目前，臨床亟須有效方法阻止實體腫瘤的進展和轉移。以siRNA為基礎的治療方法對開發展新型有效的腫瘤治療藥物、減少藥物不良反應有重要意義，有效的siRNA分子靶傳送至體內癌細胞對治療效果至關重要［19］。多個siRNA分子通過不同細胞途徑特異性靶向治療各種腫瘤，同時沉默多個致癌基因，可有效抑制惡性腫瘤的增長。

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