血液剪切力誘導的血管內皮細胞形態學變化和信號通路

陳滿軍，洪文娟，洪志鵬

(昆明醫科大學第一附屬醫院，昆明650032)

近年來，對血管內皮細胞(VEC)的研究已從靜態轉移到模擬人體血液剪切力的動態上來。目前研究成果表明，剪切力把信號傳遞到VEC內引起細胞的反應，對血液凝固、纖維蛋白溶解、血管重建有重要意義。血液剪切力發生變化時，VEC會做出一系列應答，從而可能引發一些心血管疾病［1］。因此，通過對剪切力影響下VEC的形態和分子水平的研究，可為心血管疾病的預防、治療及生物工程血管內皮細胞培養提供新的思路［2，3］。本文就剪切力和VEC的作用關系作一綜述。

1 血液剪切力對VEC形態的影響

在體外靜態培養的VEC融合成單層后整體成鋪路石樣排列，單個細胞呈三角形、橢圓形或多角形，細胞排列隨意，無規律性［4］。當血液快速而單向地通過血管時，VEC在血液剪切力的作用下呈紡錘形或梭形生長，其長軸與血液流動的方向平行［5，6］。然而，在血液剪切力作用下，VEC 的這一特征性變化是通過肌動蛋白骨架重組、肌動蛋白微絲重新排列與剪切力的方向對齊一致而達成的。VEC的骨架系統是由微絲、微管、中間絲形成的網絡與相關蛋白一起而構成的聯合結構，而肌動蛋白是微絲的主要成分［7，8］。肌動蛋白網絡是主要承受張力的細胞骨架成分，含肌動蛋白的微絲在細胞形狀的確定中起主要作用［9］。剪切力作用下VEC細胞骨架的變化除改變其形態和排列外，還涉及其通透性、遷移和增殖以及生物活性物質的合成釋放等系列細胞功能［10］。大量研究表明，剪切力通過激活一系列的力學感受器和信號分子形成網絡信號通路對VEC和細胞骨架進行調控［11～13］。

2 血液剪切力對VEC力學感受器的影響

VEC通過細胞膜上的力學感受器來感受血液剪切力的變化，把機械信號轉化為化學信號，實現對VEC和細胞骨架的調節。近年來的研究認為，細胞膜上的力學感受器主要有以下幾類。

2.1 整合素 整合素是一類跨膜蛋白受體家族，連接細胞外基質(ECM)與細胞骨架，由α和β兩個亞單位組成，兩個亞單位的胞質面對于整合素實現整個分子功能有重要作用。整合素介導的黏附或分子集聚，導致酪氨酸磷酸化。而局部黏著斑激酶(FAK)C端被稱為局部黏附的靶序列，負責FAK與整合素的結合［14］。FAK能與許多其他的信號分子和結構蛋白結合，如銜接蛋白(c-Src)、細胞骨架蛋白(裸蛋白和輔肌動蛋白-α形成黏附斑復合物(FACS)，激活觸發了一系列的第二信使酶鏈反應;或者直接激活絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)聯級反應，促進內皮細胞的生長［15］。

2.2 受體酪氨酸激酶(RTKs)RTKs可分為20個亞科。RTKs有一個跨膜域，它在結構上提供了錨定受體位點負責酪氨酸磷酸化。RTKs可以感受血液剪切力，觸發單體二聚作用改變在細胞膜上的構象［16］。酪氨酸激酶被激活使得內皮細胞一氧化氮合成酶(eNOS)促進一氧化氮(NO)產生;另外，RTKs家族中的PDGFRa作用位點在Y720，通過結合 Shb、Shf、Grb2、SHP-2 等蛋白激活 Rac/Ras通路使得細胞骨架重排［17］。

2.3 離子通道 各類型的離子通道也被認為是VEC對剪切力的力學感受器，在剪切力作用下通道被激活、開放。研究顯示，許多離子通道是剪切力反應型的。例如，瞬時受體勢離子(TRP)通道，是最大的離子通道家族之一，幾乎所有的TRP通道都是由4個同質或異質的TRP亞單位組成。剪切力激活TRP后通過第二信使系統，如二酯酰甘油 (DAG)、多不飽和脂肪酸 (PUFA)、磷脂酰肌醇(PLC)、鈣離子等傳遞來的信號［18～20］。

2.4 原纖毛 原纖毛是膜覆蓋的棒狀細胞器從細胞表面的凸出。原纖毛的核心由9個偶極微管通過微管中心進入胞質。原纖毛作為可能的剪切應力傳感器，目前提出了兩種機制解釋初級纖毛如何識別剪切應力:一種機制是彎曲原纖毛感受剪應力誘發細胞骨架變形，原纖毛功能作為一個杠桿;另一個是彎曲的原纖毛激活離子通道，導致細胞外鈣離子的流入［21～23］。

2.5 內皮細胞小窩(Caveolae) Caveolae位于VEC膜上，長度為50～100 nm。Caveolae能感受剪切應力的變化，是力傳導感受器，并介導VEC鈣信號和氧化還原信號［24］。一些研究發現，剪切力刺激下小窩附近會出現鈣離子內流，使得eNOS快速的釋放到細胞質中從而產生NO［25］。利用ATP成像技術，可以看到ATP釋放集中在小窩區域［26］。另外，細胞內皮屏障功能依賴于Caveolae和肌動蛋白的結合［27］。

2.6 G蛋白 G蛋白是一個膜內側的異型三聚體家族，該家族成員均與一類跨膜的受體蛋白直接作用，可引起膜脂質分解、產生環磷鳥苷(cGMP)以及引起鈣離子的變化，進而引發細胞內的各種磷酸化過程。剪切力被證明在無蛋白受體區域能激活純化G蛋白脂質體的重組，這也表明G蛋白本身也是一個剪切力感受器［28］。利用熒光共振實時分子成像技術，剪切應力引起緩激肽B2、G蛋白耦合受體(GPCRs)構象改變［29］。

3 剪切力對VEC作用的信號通路

研究表明，血液剪切力通過VEC剪切力感受器激活多條分子信號形成網絡通路，包括有蛋白激酶C(PKC)、Rho家族小三磷酸鳥苷(GTP)酶家族、MAPK、FAK、NF-κB、c-Src、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)等實現信號的轉導。

3.1 PKC通路 PKC屬于肌醇磷脂依賴性絲/蘇氨酸激酶家族，作為一種重要的蛋白激酶和細胞內信號分子，可作用于多種底物。例如，細胞骨架蛋白等激活后直接引起該骨架蛋白的磷酸化，調節該細胞骨架蛋白的功能。PKC可通過增加黏著斑激酶的活性、促進整合素的堿性化及調節其他蛋白質的功能而促進黏著斑(FA)形成。當胞內二脂酰甘油(DAG)和鈣離子水平的增加使PKC構象發生變化，使細胞表面有更多的整合素 β1。黏著斑蛋白是PKC重要的底物，結合后可促進更多的黏著斑蛋白形成;另一方面，PKC通過磷酸化Rho-鳥嘌呤分離抑制因子(GDI)，誘導調節Rac的活化和轉位［30］。

3.2 GTP酶通路 GTP酶屬于 Ras超家族，包括Cdc42、Rac、Rho。Rho結合二磷酸鳥苷(GDP)時無活性，結合GTP時恢復活性激活下游效應器增加細胞收縮、FA和應力纖維的形成。剪切力誘導RhoA的激活需要整合素ECM［7］，RhoA促進C-jun氨基末端激酶/激活蛋白-1(JNK/AP-1)、NF-κB、c-fos 的激活［31～33］。RhoA增加細胞收縮局部粘連，和肌動蛋白纖維形成張力;Cdc42調節絲狀偽足的形成;Rac調節細胞膜板狀偽足的形成。Rho/Rho依賴性激酶(ROCK)信號通路有重要的作用，ROCK位于肌動蛋白收縮核心，磷酸化肌球蛋白直接刺激收縮。ROCK1/2通過與RhoA結合引起應力纖維的形成。

3.3 MAPK通路 MAPK是激酶家族，包括有ERK、JNK、p38激酶。這些激酶通過蘇氨酸/酪氨酸殘基雙磷酸化，進而激活調節細胞的生長分化。剪切力能激活MAPK，其中ERK有廣泛的催化活性，是細胞對外信號反應的上游關鍵位點。剪切力變化能啟動MAPK和NF-κB途徑而引起后續的聯級反應，ERK1/2依賴c-fos基因作用的靶基因是作為cAMP應答元件結合蛋白(CREB)啟動子的cAMP應答元件(CRE)/AP-1 型元件［34］。

3.4 FAK FAK參與蛋白與蛋白的相互作用，是眾多磷酸化的位點之一;它是一個理想的力學信號傳到的錨定位點，與多個細胞表面受體和信號蛋白調節的對剪切力的應答。FAK現在被視為整合素和生長因子介導的信號通路一個集合點［35，36］。FAK通過SH2結構域與胞內信號分子非受體酪氨酸激酶(Src)和PI3K結合磷酸化，定位在肌動蛋白CSK區域，引導整合素介導的信號通路。從而激活觸發了一系列的第二信使酶鏈反應;FAK或者直接激活MAPK聯級反應。FAK激活的會造成 NF-κB磷酸化［37］。

3.5 NF-κB NF-κB 參與調控免疫學和炎癥反應的基因表達，其活性可被IκB蛋白所抑制，不能進入細胞核內。NF-κB的激活是在翻譯后水平進行的，主要通過其抑制物IκB降解實現的。剪切力可以使IκB磷酸化，蛋白酶迅速降解;NF-κB激活進入到細胞核內［38］結合于其靶基因的啟動子或增強子上，迅速誘導靶基因mRNA的合成，從而誘導內皮細胞的凋亡和炎癥因子的表達。肌動蛋白骨架的穩定與NF-κB 的激活有密切聯系［39］。

3.6 PI3K/Akt通路 PI3K可以磷酸化肌醇磷脂肌醇環上的3'-OH，是一個包括許多脂質激酶的家族，包含有相對分子質量為85 kD的調節亞基和110 kD的催化亞基，PI3K激活后產生磷酸肌醇。Akt是一種Ser/Thr蛋白激酶，又稱作PKB，是PI3K重要的下游分子;與磷酸肌醇結合后，會促進eNOS磷酸化和NO的產生［40］。通過研究，在剪切力的作用下PI3K能在15 s內激活［41］，同時也能使Akt在30 min內被激活維持6 h［40］。PI3K/Akt作用復雜，還能與下游底物磷酸化而發揮廣泛的生物學效應，包括抗凋亡、促細胞生存等功能。

剪切力在VEC重構中起著重要的作用，使得VEC呈彷錘形或梭形生長，其長軸與血液流動的方向平行;VEC通過整合素、RTKs、離子通道、G蛋白、Caveolae等力學感受器，感知剪切力的變化;從而激活多條分子信號形成網絡通路，包括有PKC、FAK、c-Src、PI3K、Rho小三鳥苷磷酸酶家族、絲裂酶原活化蛋白激酶(MAPK)、NF-κB等，實現信號的轉導，完成血管內皮細胞的重構。通過這些研究可以更好地理解循環系統血液動力學對VEC的影響，以及血液動力學因素參與的血管病理生理疾病，如高血壓、血栓的形成、動脈粥樣硬化等;同時，為組織工程設計構建人工血管和血管內皮化提供新的思路，為抑制腫瘤血管再生和抗粥樣硬化藥物尋找到新的靶點。

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