結(jié)核分枝桿菌L型的誘導及其對抗菌藥物的敏感性

張學麗，肖紅俠，吳 琦

(天津市海河醫(yī)院，天津300350)

結(jié)核病嚴重影響人類健康，抗結(jié)核藥物的出現(xiàn)使結(jié)核病得到有效控制，但近10年，結(jié)核病疫情迅速回升，尤其耐藥結(jié)核病的流行，為結(jié)核病疫情的控制帶來更大的挑戰(zhàn)。有研究［1，2］表明，結(jié)核分枝桿菌菌壁缺失變異形成L型后可長期潛伏于宿主體內(nèi)導致結(jié)核病復燃。同時有研究［3］表明，結(jié)核分枝桿菌L型是導致結(jié)核菌耐藥的原因之一。本研究觀察了結(jié)核分支桿菌L型的誘導及其對抗菌藥物的敏感性。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 結(jié)核分枝桿菌菌株 由標準結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株以比濁法稀釋成1億個菌細胞/mL的菌液備用。

1.2 培養(yǎng)基 由美國BD公司提供的960培養(yǎng)基作為結(jié)核分枝桿菌誘導培養(yǎng)基，按照文獻［4］配制培養(yǎng)基作為培養(yǎng)L型菌的非高滲培養(yǎng)基。用蒸餾水分別稀釋抗結(jié)核藥物利福平、異煙肼、乙胺丁醇的藥物原粉(Sigma公司)并加入BD960培養(yǎng)基，使其在每毫升培養(yǎng)基內(nèi)的終濃度分別為:0.05、0.1、0.2 μg利福平，0.01、0.04、0.08 μg 異煙肼，1、2.5、5 μg 乙胺丁醇。并用蒸餾水稀釋抗菌藥物原粉分別加入羅氏培養(yǎng)基及非高滲培養(yǎng)基內(nèi)，使藥物最終的質(zhì)量濃度分別為:4 μg/mL 鏈霉素、0.2 μg/mL 異煙肼、40 μg/mL 利福平、2 μg/mL 乙胺丁醇、30 μg/mL 卡那霉素、1 μg/mL 對氨基水楊酸、40 μg/mL 卷曲霉素、3 μg/mL 氧氟沙星。

1.3 L型菌判定標準 結(jié)核分支桿菌L型菌株為煎蛋樣菌落，在高倍鏡下為圓球、卵圓或不規(guī)則形態(tài)，半透明或不透明，單個或鏈狀排列，沉于瓶底，不運動，不粘附瓶壁。抗酸染色見結(jié)核分支桿菌L型細胞為抗酸染色陰性，革蘭染色可見體積較小的L型細胞呈革蘭陰性，體積較大的L型細胞則為革蘭陽性。

1.4 結(jié)核分枝桿菌L型的誘導與分離 將結(jié)核分枝桿菌接種于含不同濃度的異煙肼、利福平、乙胺丁醇的BD960液體培養(yǎng)基，置溫箱37℃培養(yǎng)10 d后行抗酸染色，顯微鏡高倍鏡下觀察L型形成情況。之后用0.22 μm孔徑濾菌器過濾培養(yǎng)物，將濾過物接種于不含任何藥物的非高滲培養(yǎng)基內(nèi)37℃培養(yǎng)并逐日觀察L型生長情況。L型密集生長(14～20/d)后，取培養(yǎng)物傳3代培養(yǎng)后作革蘭染色、抗酸染色后鏡檢。同時將結(jié)核分枝桿菌接種于不含藥物的BD960液體培養(yǎng)基內(nèi)，置溫箱37℃培養(yǎng)10 d后行抗酸染色，顯微鏡高倍鏡下觀察細菌型及L型形成情況。取培養(yǎng)物接種改良羅氏培養(yǎng)基置溫箱內(nèi)37℃分離培養(yǎng)。

1.5 結(jié)核分枝桿菌L型對抗菌藥物的敏感性檢測將結(jié)核分枝桿菌細菌型菌液及其L型的傳代純培養(yǎng)物分別接種于含不同抗菌藥物的羅氏培養(yǎng)基及非高滲培養(yǎng)基內(nèi)，肉眼及顯微鏡觀察結(jié)核分枝桿菌及其L型的生長情況，并用比例法判斷結(jié)核分枝桿菌細菌型及L型的藥物敏感性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌L型的誘導形成 培養(yǎng)10 d后，顯微鏡高倍鏡下觀察，0.05 μg 利福平、0.01 μg異煙肼、1 μg乙胺丁醇培養(yǎng)基內(nèi)均未見L型菌形成，但可見大量細菌型生長;而其他濃度藥物培養(yǎng)基內(nèi)均可見L型菌形成，同時均可見有細菌型生長，其中 0.2 μg/mL 利福平、0.08 μg/mL 異煙肼、5 μg/mL乙胺丁醇的藥物培養(yǎng)基內(nèi)的L型菌數(shù)量最多。0.1、0.2 μg/mL 利福平，0.04、0.08 μg/mL 異煙肼，2.5、5 μg/mL乙胺丁醇培養(yǎng)基的濾過液有典型油煎蛋樣菌落，顯微鏡下可見為L型菌生長，未見細菌型生長。高倍鏡下可見L型結(jié)核分枝桿菌為圓形、短桿形、不規(guī)則形，革蘭氏染色陰性;短桿形革蘭氏染色為陽性，抗酸染色為淡染。

結(jié)核分支桿菌在不含抗結(jié)核藥物的BD960液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后肉眼可見培養(yǎng)基微混濁，10 d后顯微鏡高倍鏡下可見細菌型大量生長，未見L型細胞。涂片抗酸染色可見典型形態(tài)的抗酸桿菌，接種改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)7～10 d后可見結(jié)核分支桿菌菌落生長。

2.2 結(jié)核分枝桿菌L型對抗菌藥物的敏感性 結(jié)核分枝桿菌細菌型在含有上述不同抗菌藥物的羅氏培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)14 d后均未見細菌型生長，但含有鏈霉素的培養(yǎng)基內(nèi)可見L型形成，培養(yǎng)30 d后均未見細菌型及L型生長。結(jié)核分枝桿菌L型在含有鏈霉素、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、對氨基水楊酸的非高滲培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)7 d后均可見其生長，而含有卡那霉素、卷曲霉素、氧氟沙星的培養(yǎng)基內(nèi)未見生長。

3 討論

異煙肼、利福平、乙胺丁醇作為一線抗結(jié)核藥物被廣泛應用于抗結(jié)核治療，對結(jié)核病控制起到積極作用，它們主要是通過干擾結(jié)核分支桿菌的核酸、脂肪或蛋白質(zhì)代謝而對繁殖期的結(jié)核分支桿菌產(chǎn)生抑制作用［5］。結(jié)核分枝桿菌L型是細胞壁缺陷的結(jié)核分枝桿菌，通常認為細菌在干擾細胞壁肽聚糖合成或破壞細胞壁結(jié)構的抗生素等因素的作用下，可發(fā)生細胞壁缺陷和形成L型［6］。細胞壁缺陷造成細菌喪失了抗生素作用的靶位，因此可對干擾細胞壁合成的抗菌藥物形成非遺傳性耐藥性［6］。本文結(jié)果顯示，中高濃度的異煙肼、利福平、乙胺丁醇對結(jié)核分枝桿菌細菌型具有抑制和殺滅作用，同時可誘導結(jié)核分枝桿菌L型形成并且獲得耐藥性。提示結(jié)核分枝桿菌是容易發(fā)生細胞壁缺陷的細菌，其可在許多因素的作用下發(fā)生細胞壁缺陷變異和成為L型。與王和等［7］實驗結(jié)果相比，低濃度抗結(jié)核藥物不能對結(jié)核分枝桿菌的細菌型產(chǎn)生抑制和殺滅作用，也不能誘導形成結(jié)核分枝桿菌L型形成，有可能與抗結(jié)核藥物的濃度低于其對結(jié)核分枝桿菌的抑菌濃度有關，這有待試驗進一步證實。濃度升高后抗結(jié)核藥物顯現(xiàn)出對結(jié)核分枝桿菌的抑制作用，同時也導致L型形成，L型的產(chǎn)生使結(jié)核分枝桿菌形成對利福平、異煙肼、乙胺丁醇的耐藥，這樣不但可導致臨床抗結(jié)核藥物治療無效，而且也可造成結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)潛伏存在和形成結(jié)核的潛在帶菌者與傳染源。

結(jié)核分枝桿菌L型可長期潛伏于宿主體內(nèi)導致疾病進入慢性過程，在一定條件下可以返祖造成結(jié)核病復發(fā)。本文結(jié)果可見，結(jié)核分枝桿菌L型對氨基糖甙類、喹諾酮等抗菌藥物敏感。胡忠義［8］報道結(jié)核分枝桿菌L型對鏈霉素、紅霉素、氧氟沙星、諾氟沙星等抗菌藥物均敏感，而對傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥物利福平、異煙肼、乙胺丁醇不再敏感。張世馥等［9］、馬筱玲等［10］經(jīng)實驗證實結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)變?yōu)長型后致病性大為減輕，引起的癥狀與病理變化很不典型，在臨床上容易引起漏診與誤診。以上這些因素有可能導致結(jié)核分枝桿菌L型長期潛伏體內(nèi)，并導致疾病呈慢性過程或復發(fā)、惡化。馬筱玲等［11］經(jīng)實驗證實，結(jié)核分枝桿菌細菌型與L型之間能相互變換，L型菌在一定條件下可逐漸回復成典型分枝桿菌，這也說明結(jié)核分枝桿菌L型是結(jié)核感染過程中持續(xù)存在的一種型式。結(jié)核分枝桿菌L型與結(jié)核病復發(fā)、惡化有一定關系［12］。若在患者就診時同時進行細菌型和L型培養(yǎng)，并對結(jié)核分枝桿菌L型培養(yǎng)陽性結(jié)核患者進行抗結(jié)核分枝桿菌L型治療，對提高結(jié)核病治愈率，減少復治或復發(fā)可能有一定的幫助。

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