HPLC法測定獐芽菜苦苷含量及有關物質

李大亮 張 輝 呂文博

(1.黑龍江生態工程職業學院，黑龍江 哈爾濱150025；2.哈爾濱藥業股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025)

HPLC法測定獐芽菜苦苷含量及有關物質

李大亮1張 輝2呂文博1

(1.黑龍江生態工程職業學院，黑龍江 哈爾濱150025；2.哈爾濱藥業股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150025)

目的：為更好地控制產品質量，建立獐芽菜苦苷含量及有關物質檢查方法。方法：采用高效液相色譜法，有關物質檢查方法進行專屬性、溶液穩定性及檢測限方法驗證，采用含量測定方法進行溶液穩定性、線性、準確度、精密度、重復性方法驗證試驗。結果：方法驗證結果表明所建立方法可行。結論：所建立方法可有效控制產品質量。

HPLC法；獐芽菜；苦苷；含量；有關物質；方法驗證

獐芽菜苦苷為獐芽菜中主要成分，因其藥理作用廣泛，越來越受到人們關注，市場上出現以獐芽菜苦苷為主要成分的制劑，如何控制獐芽菜苦苷制劑產品質量，顯得尤為重要。通過相關研究建立獐芽菜苦苷含量及有關物質檢查方法。

1 材料與儀器

獐芽菜苦苷對照品 來源：哈爾濱藥業股份有限公司

Agilent 1260高效液相色譜儀 廠家：安捷倫科技有限公司

色譜柱：Venusil XBP C18 4.6*250mm，5μm 廠家：天津博納艾杰爾科技有限公司

2 有關物質檢查

2.1 有關物質檢查方法篩選

參照相關文獻[1，2],對獐芽菜苦苷有關物質檢查方法進行篩選，流動相選擇甲醇及水進行篩選，根據雜質分離情況，確定流動相比例，同時進行相關方法驗證。

2.2 耐用性試驗

通過對不同廠家的色譜柱進行篩選，結果Venusil XBP C18對雜質分離最好，當甲醇∶水為30∶70時，各雜質峰與主峰可有效分離。變換柱溫，改變流速，改變流動相比例，考察雜質檢出情況，結果改變柱溫、流速、流動相比例，雜質與主峰分離度符合規定，雜質檢出量基本一致。

2.3 溶液穩定性試驗

取獐芽菜苦苷原料，加流動相制成0.25mg/ml溶液，分別于0、2、4、6、8h測定。結果供試品溶液在4h時雜質增加較明顯，供試品溶液配制后在4h內進樣。

2.4 檢測限

取獐芽菜苦苷對照品，制成不同濃度溶液，進樣，以信噪比約為3∶1為檢測限。結果本品檢測限溶液濃度為27ng/ml(信噪比為2.8)，供試品濃度與檢測限濃度比值約為8 000，溶液濃度可行。

2.5 專屬性

考察供樣品在酸、堿、氧化、高溫及強光條件下穩定性，DAD檢測器全波長監測，為確定檢測波長提供依據，評價在各條件下穩定性及可能降解產物。結果獐芽菜苦苷樣品破壞前后峰純度均符合規定(DAD監測)，說明主峰與雜質峰可有效分離。各波長監測結果表明在230nm波長處為最佳檢測波長。

2.6 已知雜質研究

專屬性試驗中發現有一雜質超過0.1%，初步分析該雜質為獐芽菜苷，取獐芽菜苷對照品進樣，結果表明該雜質為獐芽菜苷。分別取獐芽菜苦苷及獐芽菜苷對照品，配制不同濃度溶液5份，分別進樣，根據標準曲線斜率之比，計算二者相對響應因子，結果獐芽菜苷與獐芽菜苦苷相對響應因子為0.73。

2.7 有關物質檢查

色譜條件與系統適用性實驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Venusil XBP C18)；以甲醇—水(30∶70)為流動相；檢測波長為230nm。理論板數按獐芽菜苦苷峰計算應不低于5 000。取供試品加流動相制成0.25mg/ml溶液，作為供試品溶液，精密量取供試品溶液1ml于100ml，加流動相至刻度，作為對照溶液。取供試品及對照溶液進樣，獐芽菜苷不得過0.5%，單一雜質不得過0.1%，總雜質不得過1.0%。

取供試品按照確定方法檢查，結果獐芽菜苦苷為0.16%，單一未知雜質0.03%，總雜質0.31%。峰純度監測符合規定。所建立有關物質檢查方法可行，可以有效控制產品質量。

3 含量測定

3.1 方法及色譜柱

供試品溶液濃度及流動相與有關物質檢查方法相同，色譜柱Venusil XBP C18 4.6*250mm，5μm，廠家：天津博納艾杰爾科技有限公司。

3.2 系統適用性試驗

取獐芽菜苦苷對照品加流動相溶解制成0.25mg/ml溶液作為對照品溶液，精密量取對照品溶液10μl,重復進樣6次。結果重復進樣6次，主峰相對標準偏差為0.2%，保留時間相對標準偏差為0.5%，符合規定。

3.3 耐用性試驗

取對照品及供試品，按照擬建立方法通過改變流動相比例、流動相pH值、柱溫、流速及更換色譜柱(相同品牌，不同批號)考察分析方法本身偏差的影響，結果各條件微小變化含量測定結果偏差均符合規定，同時各條件下分離度及對稱因子均符合規定，塔板數較高，耐用性試驗符合要求。

3.4 線性試驗

精密稱取獐芽菜苦苷對照品，制成不同濃度的溶液，分別測定其主峰的面積。以溶液濃度為橫坐標(X)，主峰峰面積為縱坐標(Y)，結果線性試驗符合要求。

3.5 溶液穩定性試驗

取供試品加水制成0.25mg/ml的溶液，分別于0、1、2、3、4h測定溶液峰面積，溶液在4h含量下降約0.5%，供試品溶液比較穩定。

3.6 重復性試驗

精密稱取供試品，配制6份相同濃度溶液，進樣，結果6份相同濃度樣品測定結果的相對標準偏差為0.3%，符合要求。

3.7 中間精密度試驗

在不同時間由不同分析人員使用不同儀器進行試驗，精密稱取供試品溶液，配制6份相同濃度溶液，進樣，計算12次試驗測定結果相對偏差，結果12次測定結果的相對標準偏差為0.6%，中間精密度符合規定。

3.8 準確度試驗

配制濃度為80%、100%和120%的供試品溶液各三份，采用加入法測定回收率，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率。

對照品溶液制備：精密稱取獐芽菜苦苷對照品2份，分別于25ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液制備：精密稱取獐芽菜苦苷樣品2份，分別于50ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，測定供試品含量為99.3%。

供試品溶液Ⅰ制備(80%)：分別精密稱取獐芽菜苦苷供試品及獐芽菜苦苷對照品于25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，平行制備3份。

供試品溶液Ⅱ制備(100%)：分別精密稱取獐芽菜苦苷供試品及獐芽菜苦苷對照品于25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，平行制備3份。

供試品溶液Ⅲ制備(120%)：分別精密稱取獐芽菜苦苷供試品及獐芽菜苦苷對照品于25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，平行制備3份。

取上述溶液按照含量測定方法進行測定，計算回收率，結果平均回收率為99.3%、99.6%、100.1%，相對標準偏差為0.2%，準確度試驗符合要求。系統適用性、耐用性、線性、重復性、溶液穩定性、中間精密度及準確度試驗結果表明含量測定方法可行。

3.9 含量測定

取樣品，按確定的含量測定方法測定，結果分別為99.8%、99.6%、99.4%。

4 結論

本文對獐芽菜苦苷有關物質及含量檢查方法進行驗證，方法學驗證結果表明所建立方法可行，并對樣品中已知雜質進行研究，并制定合理限度，所建立方法可以有效控制產品質量。

[1]賈珍,楊鳳梅.高效液相色譜法測定藏茵陳注射液中獐芽菜苦苷的含量[J].中國現代應用藥學,2007，24(5):392～393.

[2]包同力嘎.HPLC法測定不同產地肋柱花中獐芽菜苦苷的含量[J].遼寧中醫雜志,2013，40(12):2 558～2 559.

責任編輯：桑詠梅

10.3969/j.issn.1674-6341.2014.04.011

2014-05-08

李大亮(1981-)，男，黑龍江哈爾濱人，講師，碩士。研究方向：中藥有效成分提取與分離。

R927.2

A

1674-6341(2014)04-0023-02