β淀粉樣蛋白來源的擴散性配體對胞外信號調節激酶活性的影響*

鮑兆祥，張 雪， 高 燦

(1.徐州醫學院江蘇省腦病生物信息重點實驗室，江蘇 徐州221004； 2.徐州醫學院江蘇省麻醉學重點實驗室，江蘇 徐州 221004)

前言

阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，簡稱AD)，是一組病因未明的原發性退行性腦變性疾病，是老年人最為常見的癡呆類型.隨著社會的老齡化，該病已成為現代社會老年人的主要致死疾病之一.因而，研究老年癡呆疾病早期認知功能障礙的分子機制，對預防和早期治療AD更具有臨床意義和社會價值.在AD病人的大腦中Aβ的總量是增加的，且其含量的高低與學習記憶的損傷有密切的關系.而這其中Aβ1-42具有高的疏水性，且更容易在細胞外聚集[1].因此，Aβ1-42是體外模擬AD疾病模型最常用的Aβ小肽.Aβ是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)在β- 和γ- 分泌酶相繼作用后產生的.早期認為Aβ沉積形成的淀粉樣纖維是介導神經元死亡的主要病因[2,3].但是大量臨床證據表明AD的認知功能障礙在淀粉樣纖維形成之前就有發生，淀粉樣纖維并不能解釋AD病人的認知障礙.Oda等人[4]的研究表明是可溶性的Aβ聚集體而不是Aβ纖維在AD的發病機制中發揮重要作用.Aβ寡聚體最初是被 Roher等人在1991年時發現的，直到1998年由Lambert等人將Aβ來源的擴散性配體(Aβ-derived diffusible ligands)稱為ADDLs[5]，即具有神經毒性的可溶性、非纖維化、具有配體結合特征的Aβ寡聚體.近年來越來越多的研究表明，ADDLs，這種可溶性的寡聚體作為AD發病的關鍵分子，在突觸可塑性改變和隨后的記憶功能損傷及認知功能障礙方面的作用已被廣泛接受[3,5,6].現在被普遍接受的寡聚體假說認為：Aβ升高增加了ADDLs的形成，ADDLs和相關受體以高度親和力相結合，進而誘導產生突變信號——一方面阻斷LTP導致記憶受損，另一方面持久作用于下游信號通路，導致神經元損傷死亡[3].

N-甲基-D-天冬氨酸 (N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體作為突觸后興奮性谷氨酸受體，在中樞神經系統中起著重要作用.現在研究證明NMDA受體不僅存在于突觸上，而且還存在于突觸外位點.突觸外的NMDA受體作為一種儲備受體，當突觸上的NMDA受體功能發生障礙時，突觸外儲備的NMDA受體就會通過側向的擴散進入突觸后位點，補償由于功能障礙而損失的NMDA受體，進而使得突觸正常發揮其生理功能[7,8].關于突觸外的NMDA受體的功能，一種觀點認為突觸外的NMDA受體與突觸上的NMDA受體有著截然相反的功能，突觸上的NMDA受體介導著細胞的存活，而突觸外的NMDA受體介導著細胞的死亡[9].

細胞外信號調節激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)是細胞內重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，p-ERK1/2是其活性形式[10].ERK1/2的底物包括細胞內其他重要的激酶、轉錄因子、組蛋白以及K+通道等，這些物質是細胞內的重要組成成分，在學習記憶形成過程中必不可少，同時ERK1/2可能參與了神經元形態學可塑性的形成過程[11,12].在細胞內，ERK1/2信號轉導通路可以被多種途徑激活，其中主要的有Ca2+途徑，AC/cAMP/PKA途徑，NMDA受體途徑，受體酪氨酸激酶途徑，G蛋白耦聯受體途徑等[12,13].目前，關于NMDA受體途徑如何激活ERK1/2信號轉導通路的研究受到眾多學者的認可.研究表明NMDA受體可以通過多種方式激活ERK1/2信號通路，如受體活化后引起的Ca2+內流.而且Ras和MAPK/ERK1/2三級級聯反應中，Raf-1、MEK、ERK1/2是NMDA受體復合體的主要組成成分[11～13].NMDA受體對ERK1/2信號通路的調節作用不但對突觸活動產生神經性應答，而且對認知功能以及神經可塑性都有重要作用[12～14].

有觀點認為突觸上的NMDA受體的激活引起了ERK1/2的激活，ERK1/2磷酸化后與下游物質發生一系列反應，之后被長距離運輸到細胞核內，從而發揮作用[15].雖然該理論已經被廣泛接受，但是也有人對此持不同的觀點.激活突觸外的NMDA受體會使Ras失活[16]，失活的Ras也就無法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活，進而使得ERK1/2無法向核內轉位作用其下游底物CREB.那么，ADDLs是否會對ERK1/2信號通路產生影響？ERK1/2信號通路是否受到NMDA受體的調節，到底是突觸上的NMDA受體還是突觸外的NMDA受體發揮更重要作用？ADDLs對NMDA受體的影響與ADDLs對ERK1/2信號通路產生的影響是否存在某種內在的聯系？

本文通過細胞和整體水平研究，闡明ADDLs 對ERK1/2信號通路影響的機制，揭示ADDLs影響突觸可塑性導致認知功能障礙的分子機制.本研究將拓寬研究AD疾病的新思路，并為基于ERK1/2信號通路及突觸可塑性的神經保護治療和藥物研發提供新的靶點.

1 離體實驗

1.1 ADDLs對ERK1/2信號通路的影響

1.1.1 ADDLs對ERK1/2磷酸化水平的影響

為了研究ADDLs對ERK1/2信號通路的影響，在培養的18～20 d的大鼠海馬神經元上，給予500 nmol/L ADDLs，分別作用了1 h, 3 h, 6 h, 24 h.我們首先應用免疫印跡的方法檢測了ERK1/2磷酸化水平的變化情況，結果顯示給于ADDLs 3 h, 6 h, 24 h均明顯降低了ERK1/2磷酸化水平.其中在6 h ERK1/2的磷酸化水平降到最低，24 h有所回升.

1.1.2 ADDLs對細胞不同部位ERK1/2磷酸化水平的影響

ERK1/2信號通路激活會導致ERK1/2的磷酸化，磷酸化的ERK1/2可以向核內轉位[17]，作用于核內的下游信號分子，從而發揮重要作用.那么ADDLs是否會對ERK1/2的這種轉位活動產生影響呢？為此以培養20 d的原代海馬神經元為材料，利用組分提取試劑盒，分別得到了海馬神經元不同的組分蛋白——細胞質、細胞膜、細胞核，免疫印跡結果顯示，ADDLs對細胞質、細胞膜、細胞核中ERK1/2磷酸化水平的影響在時間上呈現明顯的差異.ADDLs作用1 h后明顯降低了細胞質中ERK1/2磷酸化水平，但是細胞膜中ERK1/2磷酸化水平在6 h才出現顯著性降低，而細胞核中則需要24 h才有顯著性降低的表現.

1.2 ADDLs通過突觸外NMDA受體影響ERK1/2信號通路

研究表明，激活突觸外的NMDA受體會使Ras失活[16]，失活的Ras也就無法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活，進而使得ERK1/2無法向核內轉位作用其下游底物CREB.在前言中也提到GluN2B亞基主要分布在突觸外膜上，那么ADDLs是否通過突觸外NMDA受體影響ERK1/2信號通路？在培養的大鼠海馬神經元上，按高燦等人已建立的方法[18],選擇加入NMDA 20 μmol/L、Gly 20 μmol/L激活5 min，制作激活突觸外的NMDA受體的細胞模型.IB結果顯示，單獨激活突觸外的NMDA受體和給予ADDLs后再激活突觸外的NMDA受體，ERK1/2的磷酸化水平均明顯降低，沒有顯著性差異.這說明ADDLs通過突觸外受體影響ERK1/2信號通路.

2 在體實驗

2.1 APP小鼠學習記憶受損

將飼養至9個月的轉入APP(淀粉樣前體蛋白)基因的AD模型小鼠(簡稱APP小鼠)，按基因型分為WT(野生型)組和APP組，進行水迷宮實驗.小鼠連續接受5天訓練，每天4 次，每次在平臺上逗留30 s, 記錄小鼠分別從4個象限不同入水點入水找到平臺所需的時間，即潛伏期(escaping latency).4 次潛伏期成績的平均值作為當日最終成績進入最后統計.如果小鼠在90 s 內未找到平臺，其潛伏期按90 s 計算.記錄小鼠每天在平臺所在象限即目的象限(target quadrant)停留的時間.第6天撤除平臺，從任一入水點將小鼠面向池壁放入水中，記錄90 s 內小鼠的游泳軌跡并進行分析.觀察分析小鼠停留各象限的時間百分比.迷宮上方安置帶有顯示系統的攝像機，計算機自動跟蹤計時并記錄游泳軌跡，Anymaze軟件分析結果.水迷宮實驗顯示APP小鼠比野生型的小鼠要花更長的時間才能找到目標平臺，說明APP小鼠的學習記憶已經受損.

2.2 APP小鼠ERK1/2磷酸化水平降低

APP小鼠是目前比較常用的用于研究AD的實驗動物，由于該小鼠轉入了APP基因，所以其大腦中能夠產生大量的Aβ，且Aβ能夠在細胞外寡聚化進而形成ADDLs，而ADDLs是目前認為的損傷學習記憶的主要元兇之一.分別將WT與APP組實驗小鼠深度麻醉斷頭取海馬進行樣品的處理，進行免疫印記分析.結果顯示，APP小鼠ERK1/2的磷酸化水平顯著降低.

3 討論

AD的主要癥狀是記憶喪失，雖然目前有一些關于ADDLs如何最終損傷學習記憶的研究，也有很多有意義的研究結果，但是依然有很多機制有待去了解.MAPK/ERK信號通路與腦內長時程增強(LTP)的形成以及學習記憶功能的重要聯系一直是眾多學者研究的熱點.研究結果表明,ERK1/2可以通過多種方式影響中樞神經系統信息的長期存儲[11～13]，如ERK1/2調控海馬神經元樹突棘結構的形成與變化；ERK1/2可直接參與調控樹突蛋白合成，且此蛋白合成為LTP形成及記憶功能所必需；ERK1/2與突觸結構蛋白(如腳手架蛋白)的相互作用共同參與突觸和神經元的可塑性改變，最終影響學習記憶功能.研究結果顯示，ADDLs以時間依賴的方式抑制ERK1/2磷酸化水平.

ERK1/2信號轉導通路被認為是細胞外多種刺激傳向細胞內的交匯點[14].在細胞內能引起ERK1/2信號轉導通路激活的路徑主要有[11～13]：Ca2+途徑；AC/cAMP/PKA途徑；NMDA受體途徑；受體酪氨酸蛋白激酶途徑；G蛋白耦聯受體途徑.其中NMDA受體途徑被研究的最為廣泛.NMDA受體激活引起的Ca2+內流激活ERK1/2信號轉導通路，一直以來都是人們研究的熱點.另外，Ras、MERK1/2/ERK1/2三級級聯反應中的Raf-1、MEK、ERK1/2是NMDA受體復合體的主要組成成分.受體酪氨酸蛋白激酶是催化NMDA受體發揮生物學功能的主要激酶.NMDA受體必須通過相關腳手架蛋白錨定于突觸后膜上[19].突觸內與突觸外的NMDA受體有著不同的結構組成以及介導了不同的下游通路：激活突觸內的NMDA受體促進細胞存活，而激活突觸外的NMDA受體導致細胞死亡[14,20].早在1991年Bading等[14]報道了NMDA受體介導的Ca2+內流激活了ERK1/2，而這一過程是Ras依賴的，而激活突觸外的NMDA受體會使Ras失活[20,21]，失活的Ras也就無法使其下游底物ERK1/2磷酸化激活.此外，當突觸上的NMDA受體與突觸外的NMDA受體同時被激活時，突觸外的NMDA受體激活產生的效應占主導地位[22].研究結果顯示，當特異性激活突觸外NMDA受體，與對照組相比ERK1/2磷酸化水平明顯降低.給予ADDLs(500 nmol/L)3 h后再激活突觸外NMDA受體，ERK1/2的磷酸化水平較單獨激活突觸外NMDA受體組相比，具有更加明顯的降低.說明ADDLs可能通過過度激活了突觸外的NMDA受體，抑制了ERK1/2信號通路的激活.另外，我室前期研究結果表明，當GluN2B的特異性抑制劑Ro-256981與ADDLs聯合給藥時，ERK1/2的磷酸化水平較單獨給予ADDLs組得到了恢復，而Ro-256981本身并不影響ERK1/2的磷酸化水平.結合下面的觀點：在突觸發生階段，突觸外NMDA受體主要由GluN2B組成，但不包含GluN2A；隨著神經元的成熟，突觸外NMDA受體的組成基本不變，此時突觸上NMDA受體則主要由GluN2B逐漸轉化為GluN2A[23～25].可以得到這樣一個結論：ADDLs通過過度激活了突觸外的NMDA受體，抑制了ERK1/2信號通路的激活.

激活的 ERK 可能有 3 種去向[26]:1)停留在胞質中，激活一系列其他蛋白激酶；2)在胞質中使細胞骨架成分磷酸化； 3)進入細胞核，通過磷酸化轉錄因子，調控基因的表達最終介導細胞的生長、分化、遷移、侵襲等多種過程.那么ADDLs通過過度激活了突觸外的NMDA受體，抑制的ERK1/2信號通路發揮作用是否具有特異性？研究結果顯示，ADDLs對細胞質、細胞膜、細胞核中ERK1/2磷酸水平的影響在時間上呈現明顯的漸進性.ADDLs作用1h后明顯降低了細胞質中ERK1/2磷酸化水平，但是細胞膜中ERK1/2磷酸化水平在6 h才出現顯著性降低，而細胞核中則需要24 h才有顯著性降低的表現.說明ADDLs對ERK1/2信號通路的影響在時間和空間上均有不同，即ADDLs對ERK1/2信號通路的影響是有一定的時序性.這也提示了作為多種信號通路的匯集點，ERK1/2信號傳導是非常精確和復雜的.

ADDLs影響學習記憶的機制是復雜的，其中絕大多數機制是不明確的.實驗結果表明，ADDLs通過過度激活了突觸外的NMDA受體，抑制了ERK1/2信號通路的激活，而ADDLs對ERK1/2信號通路的影響具有一定的時序性.ADDLs在抑制該通路的同時也可能抑制了其他有助于學習記憶形成與鞏固的通路，這些通路有的是已知的，然而絕大多數是未知的.筆者僅對該通路進行了觀測，研究結果僅表明ADDLs通過過度激活了突觸外的NMDA受體，抑制了ERK1/2信號通路的激活，是導致學習記憶能力降低的可能原因之一.希望本研究為研究AD學習記憶損傷提供一個新的思路和方向，為將來AD的治療提供理論基礎.

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