牦牛PAFR基因生物信息學分析及其在妊娠前后子宮中的表達

魏博 潘陽陽 禹堯 田楓 余四九

（甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070）

牦牛PAFR基因生物信息學分析及其在妊娠前后子宮中的表達

魏博 潘陽陽 禹堯 田楓 余四九

（甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070）

以牦牛血小板活化因子受體（Platelet-activating factor receptor，PAFR）基因為研究對象，采取西寧家養牦牛子宮為材料，采用RT-PCR技術克隆牦牛PAFR基因，對其進行生物信息學分析，并采用QRT-PCR方法定量檢測PAFR在牦牛子宮不同時期的表達。結果表明，牦牛PAFR基因編碼區長1 029 bp，編碼342個氨基酸；氨基酸序列與黃牛同源性最高為99.7%，與非洲爪蟾蜍同源性最低為59.1%，表明PAFR氨基酸在進化過程中具有保守性；其編碼蛋白的氨基酸序列有5個跨膜區域，推測其可能為跨膜蛋白；具有親水性；未發現信號肽片段；含有G蛋白偶聯受體家族結構域；QRT-PCR檢測PAFR在牦牛子宮中表達，妊娠期最高，卵泡期最低，黃體期居中，揭示其與胚胎附植，妊娠維持有關。

牦牛 PAFR 基因克隆 生物信息學分析 基因表達

牦牛是中國僅次于黃牛和水牛的主要牛種之一，也是牛屬動物中能適應高寒氣候而延續至今的珍稀畜種資源。其主要分布在我國青藏高原和甘肅等地。由于其繁殖能力不強，所以利用日趨完善的人工受精及胚胎移植等技術對牦牛進行珍惜物種資源保護，提高其繁育生產能力必將成為未來發展趨向。

血小板活化因子（Platelet-activating factor，PAF）是一種內源性磷脂遞質，其化學名稱為1-O-烷基-2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿。PAF是目前發現的作用最強的脂質遞質，它廣泛存在于各種組織［1］。PAF在生殖方面具有多種生物學活性，其在受精、附植和妊娠過程中扮演重要角色［2，3］。目前以PAF在子宮中的表達研究較多。1986年Yasuda 等［4］在小鼠子宮中發現PAF濃度變化，O'Neil等［5］也發現PAF與小鼠附植前胚胎發育關系密切。不久Angle等［6］證實了家兔子宮中PAF濃度變化與附植過程有關。而PAF的生物學活性是通過與其受體（Platelet-activating factor recepter，PAFR）結合從而表達的。PAFR是在［3H］-PAF和PAF受體拮抗劑——［3H］-WEB2086的配體結合試驗中發現的［7，8］。1991年Honda等［9］建立了豚鼠肺PAFR的cDNA克隆，并成功進行了表達。后續研究中，在兔［10，11］、人［12］、牛［13］、犬［14］的子宮中也都檢測到了PAFR的分布，但PAFR在牦牛子宮中還未被檢測到。鑒于此，本研究對牦牛PAFR基因編碼區序列進行克隆，對其編碼蛋白序列進行生物信息學分析，并檢測其在妊娠前后牦牛子宮中的含量。以期闡明牦牛PAFR基因分子的遺傳特性，為進一步揭示PAF在牦牛生殖過程中發揮的作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 青海省西寧市定點屠宰場。分別取卵泡期、黃體期、妊娠期雌性牦牛子宮組織樣，用錫紙包裹后放入標記好的布袋中，立即投入液氮中帶回，-80℃保存備用。

1.1.2 主要儀器和試劑 羅氏 LightCycler 480定量PCR儀，Bio-Rad常規PCR儀；引物由上海華大基因合成；柱式動物組織RNA抽提純化試劑盒，Taq PCR Master Mix購自生工生物公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，pMDR18-T vector購自 TaKaRa公 司，Gel Extraction Kit（100）D2500-01購自OMEGA公司，TransStartTMTop Green qPCR SuperMix購自TransGen Biotech公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 從GenBank 數據庫中檢索黃牛的PAFR基因（XM_005203162.1）的cDNA序列和β-actin基因（XM_004970638.1），用Primer Premier 5設計4對引物（表1）。其中引物1、2為用于RT-PCR的PAFR引物；引物3為用于QPCR的PAFR引物。β-actin引物作為內參檢測引物。

1.2.2 總RNA的提取及反轉錄 用生工生物工程柱式動物組織RNA抽提純化試劑盒提取總不同時期牦牛子宮RNA，具體步驟參照說明書。用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）對總RNA 進行反轉錄，合成牦牛子宮的cNDA。具體操作步驟參照說明書。采用β-actin為內參基因，β-actin引物引自Ann-Sofi Bergqvist，PCR擴增后，1.5%瓊脂糖凝膠電泳和紫外線分光光度計檢測cDNA的質量，-20℃保存。

1.2.3 牦牛PAFR基因的擴增與克隆 引物1、引物2及β-actin引物的擴增體系及反應條件相同。反應體系：上下游引物各0.5 μL（10 pmol/L），模板1 μL，Taq PCR Master Mix（生工生物公司）10 μL，無菌去離子水8 μL。反應條件：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸40 s，34個循環；72℃延伸10 min。擴增產物的大小及質量用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將目的條帶用Gel Extraction Kit（100）D2500-01（OMEGA公司）回收純化，將純化好的cDNA與pMDR18-T vector連接，并轉化到JM109感受態細胞中，將菌液送華大基因測序。

1.2.4 牦牛PAFR基因的生物信息學分析 用MEGA5軟件對克隆測序得到的目的基因進行拼接編輯，及基因編碼氨基酸序列的推導；用ORF Finder軟件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）進行開放閱讀框分析；用在線軟件ProtParam（http：//web. expasy.org/protparam/）分析牦牛PAFR基因編碼蛋白理化性質；用ProtScale（http：//web.expasy.org/prots cale/）軟件分析其疏水性質。

利用NCBI的BLAST在線軟件進行對比分析，再用DNAMAN軟件進行同源性分析；使用MEGA 5.1 軟件構建PAFR基因的系統發生樹。用于同源性及系統進化分析的其他物種的PAFR基因序列從GenBank中下載，各物種PAFR基因序列登錄號，見表2。

用在線軟件SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP-4.1/）分析預測蛋白質的信號肽位點；用在線軟件TMHMM Server V 2.0（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對預測蛋白進行跨膜區分析。

使用軟件Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interp ro/）預測蛋白所包含的結構域；用在線軟件SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= /NPSA/npsa_sopma.html）預測蛋白質的二級結構；用在線軟件SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expas y.org/）對牦牛PAFR蛋白進行三級結構預測。

1.2.5 妊娠前后牦牛子宮中PAFR基因的檢測 牦牛子宮按照卵泡期、黃體期、妊娠期分為3組，每組3個復孔，分別為待測孔、內參對照孔和空白對照孔，每組3個重復。將各組樣品cDNA濃度均調至160 ng/μL。反應體系（20 μL）體系：2× TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。擴增程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，57℃ 15 s，72℃ 15 s，45個循環；95℃ 5 s，65℃ 1 min；40℃ 30 s。試驗數據用SPSS 19.0軟件進行分析。

2 結果

2.1 牦牛PAFR基因的擴增與克隆

反轉錄獲得的cDNA經PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測后，結果如圖1所示。擴增產物大小與引物預期產物大小一致。用MEGA軟件進行拼接編輯后，利用NCBI的BLAST軟件在線比對分析確定，PAFR與其引物設計參考序列一致性為99%，因此可以判定引物1、2經拼接編輯得出序列為牦牛PAFR基因。并已將其提交保存到GenBank中，收錄號為KF771404。

2.2 牦牛PAFR基因的生物信息學分析

2.2.1 牦牛PAFR基因編碼蛋白的理化性質 測序結果經MEGA5軟件拼接后，獲得的PAFR基因序列用在線軟件ORF Finder，檢測到一條長1 029 bp的開放閱讀框，推測可編碼342個氨基酸。使用在線軟件ProtParam 預測牦牛PAFR基因編碼蛋白的理化性質發現，該蛋白分子量為39.637 kD，理論等電點為9.16。含有20種氨基酸，其中含量最高的是Leu（12.0%），含量最低的為Met（1.8%）、Trp（1.8%）。含有帶負電氨基酸（Asp + Glu）21個，帶正電氨基酸（Arg+ Lys）33個。利用在線軟件ProtScale分析牦牛PAFR基因氨基酸序列的親疏水性結果（圖2）表明，PAFR 氨基酸序列第199、200位Leu、Phe預測的分值最高為3.667，其疏水性最強；第160位Lys分值最低為-2.833，其親水性最強。牦牛PAFR基因編碼的整個氨基酸序列中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此整體表現為親水性。

2.2.2 牦牛PAFR基因編碼蛋白的系統發育分析 利用DNAMAN軟件對牦牛PAFR基因的核苷酸序列與牛、人、藏羚羊、野豬、犬、虎鯨、非洲爪蟾蜍、大鼠、小鼠等物種進行同源性對比，結果見表2。分析發現牦牛PAFR氨基酸序列與其它物種的相應序列有較高的同源性，其中與黃牛的同源性最高為99.7%；其次是藏羚羊和綿羊，同源性為96.8%；與非洲爪蟾蜍的同源性最低，為59.1%。根據與其他物種的同源性對比結果，使用MEGA 5.1軟件中的最大可能性法（Maximum Likelihood methods）繪制出PAFR基因的系統進化樹，如圖3。

2.2.3 牦牛PAFR基因編碼蛋白信號肽、跨膜區及結構域分析 利用SignalP軟件對牦牛PAFR進行信號肽預測，結果顯示序列中無信號肽，如圖4。

利用TMHMM軟件對牦牛PAFR進行跨膜區分析，結果顯示PAFR有5個跨膜區，有139個氨基酸殘基在細胞外，如圖5，推測PAFR可能是跨膜蛋白。

利用Interpro軟件預測牦牛PAFR蛋白結構域，結果如圖6所示，該序列在第32-293位氨基酸之間有G蛋白偶聯受體（GPCR）家族蛋白功能結構域，同時在2-20、39-55、73-89、109-134、149-171、171-188、211-232、247-261、268-280、294-316及317-341位氨基酸之間有血小板活化因子受體（PAFR）家族蛋白功能結構域。

2.2.4 牦牛PAFR基因編碼蛋白二級結構、三級結構預測 使用SOPMA 軟件預測牦牛PAFR蛋白的二級結構，結果（圖7）表明，該蛋白α-螺旋區為130個氨基酸，占38.01%；延伸鏈為85個氨基酸，占24.85%；β-轉角為5 個氨基酸，占1.46%；無規卷曲為122個氨基酸，占35.67%。

利用Swiss Model 數據庫預測該蛋白的三維結構，提交序列至Swiss Model服務器進行自動建模，得到其三維結構。如圖8所示，PAFR蛋白為一種結構較松散的球狀蛋白。

2.3 PAFR在妊娠前后牦牛子宮中的表達

由相對定量的結果可知，PAFR基因在妊娠期子宮中的表達量最高，以妊娠期牦牛子宮△Ct平均值為基準，其余兩時期的△Ct平均值分別與妊娠期△Ct平均值作差，即得到△△Ct，其他兩時期PAFR基因的表達量相對于妊娠期PAFR基因的表達量即為2-△△Ct。從表3、圖9可以看出，牦牛PAFR基因在妊娠期的表達量，約是在黃體期表達量的1.6倍，是卵泡期表達量的2.8倍。

3 討論

血小板活化因子（PAF）能夠廣泛參與排卵、附植、胚胎發育及妊娠等生殖生理活動［15］，因其生物學活性是通過與其受體（PAFR）特異性結合從而表達，因此PAFR基因近年來備受關注。本試驗克隆了牦牛PAFR基因，然后對該基因進行了生物信息學分析，并對其在妊娠前后牦牛子宮中的表達量進行了檢測。結果表明，PAFR基因含有一個1 029 bp的開放閱讀框，編碼342個氨基酸。其編碼氨基酸序列經推測有5個跨膜區，說明牦牛PAFR蛋白為跨膜蛋白，結構域預測發現牦牛PAFR蛋白含有G蛋白偶聯受體家族結構域，說明其屬于G蛋白偶聯受體家族，這與Honda等［9］的結論相符。自1991年Richard等［16］克隆出人PAFR基因，已有10余種物種PAFR基因被克隆出來，本試驗通過對不同物種PAFR氨基酸序列對比分析，發現牦牛PAFR氨基酸序列與黃牛PAFR氨基酸同源性最高為99.7%，與其它物種也有較高的同源性，表明PAFR氨基酸在進化過程中具有保守性。

O’Neill等［17］認為附植前胚胎產生的PAF介導妊娠母體對胚胎的識別，引起母體對妊娠的最初反應，以及胚胎附植時母胎界面伴隨的炎癥可能也和PAF 密切相關。本試驗采用QRT-PCR的方法相對定量檢測出PAFR在妊娠前后牦牛子宮中的表達量，結果顯示妊娠后子宮內的PAFR表達量明顯高于妊娠前各時期。揭示PAFR在牦牛妊娠過程中扮演重要作用，這與O’Neill［5］、Angle等［6］在鼠和家兔子宮中的發現一致，進一步驗證了PAF對胚胎附植，維持妊娠起到了重要作用。本試驗首次在牦牛子宮中克隆出PAFR，并全面地對PAFR進行了生物信息學分析，為以后深入研究PAF及PAFR提供了可靠依據。

4 結論

牦牛PAFR基因，其開放閱讀框全長1 029 bp，編碼342個氨基酸；與黃牛相比氨基酸同源性最高為99.7%，較保守；該蛋白為跨膜蛋白，有親水性，具有G蛋白偶聯受體家族結構域；在牦牛子宮中PAFR表達，妊娠期高于妊娠前，說明其與胚胎附植，維持妊娠有關。

［1］ 夏國棟, 夏時海.血小板活化因子受體的研究進展［J］.世界華人消化雜志, 2005, 13（3）：381-384.

［2］ 胡承閱.血小板活化因子在受精和著床中的意義［J］.生殖與避孕, 1991, 11（3）：7-10.

［3］ 唐術成.血小板激活因子與妊娠［J］.生殖與避孕, 1991, 11（2）：3-5.

［4］ Yasuda K, Satouchi K, Saito K. Platlelt-activating factor in normal rat uterus［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1986, 138：1231-1236.

［5］ O'Neill C, Ammit AJ. The role of albumin in the release of plateletactivating factor by mouse preimplantation embryos in vitro［J］. Journal of Reproduction and Fertility, 1997, 109：309-318.

［6］Angle MJ, Jones MA, McManus LM, et al. Platelet-activating factor in the rabbit uterus during early pregnancy［J］. Journals of Reproduction, 1988, 83：711-722.

［7］Sugatani J, Lee DY, Hughes KT, Saito K. Development of a novel scintillation proximity radioimmunoassay for platelet-activaing factor measurement：comparison with bioassay and GC/MS techniques［J］. Life Sci, 1990, 46：1433-1450.

［8］Korth R, Zimmermann K, Richter WO. Lipoprotein-associated paf（LA-paf）was found in washed human platelets and monocyte/ macrophage-like U937 cell［J］. Chem Phys Lipids, 1994, 70：109-119.

［9］Honda Z, Nakamura M, Miki I, et al. Cloning by functional expression of platelet-activating factor receptor from guinea-pig lung［J］. Nature, 1991, 349：342-346.

［10］Kudolo GB, Harper MJK. Characterization of platelet-activatingfactor binding sites on uterine membranes from pregnant rabbits［J］. Biol Reprod, 1989, 41：587-607.

［11］ Kudolo GB, Kasamo M, Harper MJK. Autoradiographic localization of platelet-activating factor（PAF）binding sites in the rabbit endometrium during the periimplantation period［J］. Tissue Res, 1991, 265：231-241.

［12］ Zhu YP, Word RA, Johnston JM. The presence of platelet-activating factor binding sites in human myometrium and their role in uterine contraction［J］. Am J Obstet Gynecol, 1992, 166：1222-1228.

［13］ Tiemann U, Tomek W, Schneider F. Platelet-activating factor（PAF）-like activity, localization of PAF receptor（PAF-R）and PAF acetylhydrolase（PAF-AH）activity in bovine endometrium at different stages of the estrous cycle and early pregnancy［J］. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 2001, 65（2-3）：125-141.

［14］ Schafer-Somi S, Sabitzer S, Klein D, et al. Vascular endothelial（VEGF）and epithelial growth factor（EGF）as well as plateletactivating factor（PAF）and receptors are expressed in the early pregnant canine Uterus［J］. Reproduction in Domestic Animals, 2013, 48：20-26.

［15］ Tiemann U. The Role of Platelet-activating factor in the mammalian female reproductive tract［J］. Reproduction in Domestic Animals, 2008, 43：647-655.

［16］ Richard D, Eric R, Zou A, Charles G. Characterization of a human cDNA that encodes a functional receptor for platelet activating factor［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1991, 180（1）：105-111.

［17］ O’Neill C. The role of PAF in embryo physiology［J］. Hum Reprod Update, 2005, 11（3）：215-228.

（責任編輯 李楠）

Cloning and Sequence Analysis of Yak PAFR Gene and Expression in Uterus Before and After Pregnancy

Wei Bo Pan Yangyang Yu Yao Tian Feng Yu Sijiu
（College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070）

Platelet-activating factor receptor（PAFR）gene were cloned from uterus of domestic yak by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）. The results shows that domestic yak PAFR gene was 1 029 bp in length, encoded predicted mature protein of 342 amino acids, which encoded a hydrophilic protein. Compared with the reference sequence of PCR primer designing homology of the domestic yak PAFR coding sequence was 99.7% at the amino acid level, and also showed high homology of with other species. The PAFR has 5 transmembrane domains, features G protein-coupled receptor domains, no signal peptide. The result of the quantitative Real-time Polymerase chain reaction（QRT-PCR）shows that PAFR was highest expression in gestation and lowest in follicular phase in uterus of domestic yak. That suggested PAFR play an important role in implantation and gestation.

Yak PAFR Gene cloning Bioinformatic analysis Gene expression

2014-01-09

國家自然科學基金項目（32172616）

魏博，男，碩士研究生，研究方向：動物生殖生理；E-mail：jl_wb_cloud@163.com

余四九，男，教授，博士生導師，研究方向：動物生殖生理；E-mail：sjyu@163.com