柴油降解菌Acinetobacter sp. AK5的篩選及其降解性能研究

徐曉宇 陳敬華

（江南大學醫藥學院，無錫 214122）

柴油降解菌Acinetobacter sp. AK5的篩選及其降解性能研究

徐曉宇 陳敬華

（江南大學醫藥學院，無錫 214122）

從污水處理廠的活性污泥中分離到一株柴油降解菌，通過生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，鑒定該菌為不動桿菌Acinetobactersp. AK5。檢測了不同pH值、NaCl濃度、培養時間和各種柴油濃度下Acinertobactersp. AK5的柴油降解情況。結果表明，該菌的最適生長初始pH值為5-9，適合NaCl濃度為3%-4%，柴油濃度為5 g/L時，該菌7 d柴油降解率可達99%，柴油濃度為20 g/L時，7 d柴油降解率也可達67%。AK5在人工海水培養基中及無機鹽培養基中生長狀態良好，在海水和淡水石油污染的生物修復中具有很好的應用前景。

柴油 降解 不動桿菌 降解率

由于全球性廣泛的石油開采、運輸、使用和處置，石油及其產品的泄漏已經成為世界性的環境問題。在土壤、海洋和大氣環境中的石油污染日益嚴重。據統計全世界每年有1×109t原油及其產品進入環境中，污染土壤、地下水、河流和海洋［1，2］。當前，海洋的石油污染日趨加劇，石油的主要成分包括烷烴、芳香烴和多環芳烴等，石油進入海洋水體后，會產生大面積的油膜，石油污染影響景觀，破壞物理環境，油膜能黏附魚卵與幼魚，使其死亡。同時油膜減少了太陽輻射投入海水的能量和進入海水中氧的數量，阻隔了海水和空氣的相互作用和熱交換，阻止海水蒸發，造成水生動物缺氧死亡，從而降低了海洋的自凈能力，影響海洋生物的光合作用和生物鏈循環，進而使海洋生態系統遭到嚴重破壞，導致受污染的海洋生態系統經過幾十年都難以修復［3］。

石油烴污染的處理方法有物理法、化學法和生物法。其中生物處理方法相對于物理和化學方法具有費用低、無二次污染等優點。目前，國內外針對石油烴的微生物降解首先集中于單純或混合微生物培養物對石油烴的降解動力學及其降解情況［4-6］，近幾年，添加表面活性劑［7-9］、添加碳源［10-12］和其它技術［13-16］在提高微生物的石油烴降解效率的研究也有報道。國內外學者也進行了很多關于海洋石油降解菌的篩選研究［17-19］，本研究從污水處理廠的活性污泥中篩選出一株高效柴油降解菌，并對其進行鑒定，研究其在人工海洋培養基中的柴油降解條件以及降解特性，旨在為其在海洋石油污染治理方面的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 從無錫某生活污水處理廠二沉池中采集活性污泥，用無菌采樣瓶帶回實驗室，4℃保存備用。

1.1.2 培養基 菌株傳代用培養基（LB培養基）：蛋白胨10.0 g/L；酵母粉5.0 g/L；NaCl 10.0 g/L；pH 7.0-7.2。

無機鹽培養基：柴油10.0 g/L；KH2PO4 2.0 g/L；K2HPO42.0 g/L；KNO31.0 g/L；（NH4）2SO42.0 g/L；NaCl 1.0 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；CaCl2·H2O 0.02 g/L；FeCl2·7H2O 0.01 g/L［6］；微量元素液1 mL，維生素B1 0.004 g/L，pH7.0-7.2，121℃濕熱滅菌20 min后補加微量元素液混合液2 mL（經0.22 μm濾膜過濾除菌）。微量元素液配方：H3BO30.1 g/L；MnCl2·4H2O 0.1 g/L；ZnSO4·H2O 0.1 g/L；FeCl3·6H2O 0.1 g/L；CaCl21.0 g/L；CuCl2·2H2O 0.05 g/L。

人工海水培養基（MMC）：NaC1 24 g，KC1 0.7 g，MgSO4·7H2O 0.7 g，NH4NO31 g，KH2PO42 g，Na2HPO4·12H2O 3 g，蒸餾水1 L，pH7.4，并補加柴油10 g作為唯一碳源（0.45 m濾膜過濾除菌）配制。121℃濕熱滅菌20 min后補加微量元素液混合液2 mL（經0.22 μm濾膜過濾除菌）。微量元素溶液：MgSO4·7 H2O 4 g，CuSO4·5H2O 1 g，MnSO4·H2O 1 g，FeSO4·7H2O 1 g，CaC121 g，蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 柴油降解菌的富集和分離

1.2.1.1 菌源富集 配制無機鹽培養基，250 mL的三角燒瓶加入100 mL培養基，滅菌后，加入活性污泥，加入1 mL柴油，放入恒溫振蕩培養箱以轉速120 r/min，30℃恒溫培養。取上述培養3 d后的混合培養液進行接種馴化，30℃、150 r/min恒溫振蕩培養7 d。馴化時，先取5 mL富集后的培養液到含有最低柴油濃度的新鮮馴化培養液中，培養7 d，然后從中取出5 mL培養液加入含有較高原油濃度的馴化培養液中，再次培養7 d。重復3次。

1.2.1.2 單菌株的分離 將篩選出的能以柴油為唯一碳源生長的混合菌分別接種到柴油濃度為0.5%的人工海水培養基中，在恒溫搖床上進行振蕩培養，在LB固體培養基上利用平板劃線方法進行單菌株的分離。

1.2.2 柴降解菌株的鑒定 將一株降解能力較好的菌株命名為AK5，將該菌株劃線接種LB培養平板上培養后挑取單菌落，于斜面培養進行培養24 h，革蘭氏染色后并進行生理生化鑒定。用DNA快速提取試劑盒提取菌株AK5基因組DNA，采用16S通用引物（27F：5'-AGAGTTTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對AK5的16S rDNA序列進行PCR 擴增，反應體系（25 μL）為：模板DNA 1 μL，Taq10×緩沖液5 μL，dNTP 100 mol/L，DNA聚合酶2.5 U，上下游引物各1 μL。PCR反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，循環30次；72℃延伸10 min。電泳割膠回收后，將PCR產物與pMD19-T載體連接，轉化到大腸桿菌JM109感受態細胞中，通過藍白斑篩選陽性重組子，送華大基因測序。將測得的16S rDNA序列在NCBI的GenBank進行比對，對獲得的同源序列進行分析，采用Neighbor-Joining（N-J）法構建進化樹。

1.2.3 柴油降解菌降解特性

1.2.3.1 pH對菌株柴油降解的影響 將體積分數10%的AK5菌液接種到人工海水培養基中，在30℃，200 r/min，柴油濃度為10 g/L，pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，培養7 d，分別檢測其柴油降解率。

1.2.3.2 NaCl濃度對菌株柴油降解的影響 將AK5菌液按照10%體積比接種到NaCl分別為0、1%、2%、3%、4%和5%的人工海水培養基中，在30℃，200 r/min，柴油濃度為10 g/L的條件下培養7 d，分別檢測其柴油降解率。

1.2.3.3 柴油濃度對菌株柴油降解的影響 將AK5按照10%體積比接種到人工海水培養基中，其柴油濃度分別為5、10、15和20 g/L，培養7 d，每天取樣，檢測其在不同柴油濃度下的柴油降解率。

1.2.3.4 培養基對AK5柴油降解的影響 將AK5按照10%體積比分別接種到無機鹽培養基和人工海水培養基中，柴油初始濃度為5 g/L。每天取樣，檢測其不同培養基培養條件下的柴油降解率。

1.2.4 柴油降解率的檢測 將AK5在含不同石油烴組分培養液中培養，以紫外分光光度法在230 nm波長下檢測柴油濃度［20］計算降解率。

2 結果

2.1Acineitobactersp. AK5菌株的形態特征與16S rDNA序列分析

柴油降解菌Acinetobactersp. AK5，菌落圓形，黃白色，表面光滑，革蘭氏染色陰性球桿菌、無鞭毛、有莢膜、不產芽孢、不發酵葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、吲哚試驗陰性、甲基紅試驗結果陰性、VP試驗陰性，有溶血環。經16S rDNA測序及GenBank比對，并采用N-J法構建分子進化樹，該菌與不動桿菌屬有99%以上的相似性，綜合上述分析結果將此菌株鑒定為不動桿菌菌屬，命名為AK5（圖1）。

2.2 AK5在不同初始pH值下的柴油降解率

柴油降解菌AK5在不同初始pH條件下的柴油降解率（圖2）顯示，AK5在初始pH為6時降解率最高，可達90%，而在初始pH10時柴油的降解率則降到10%以下。細菌在pH5-9的范圍內均有較好的降解率，說明AK5適合在中性偏堿性的條件下生長。而AK5在pH6-9范圍內7 d柴油降解率均可以達到50%以上，能更好地適應海洋環境。

2.3 AK5在不同NaCl濃度下的柴油降解率

研究了NaCl濃度為0-5%條件下柴油降解菌的降解情況（圖3）表明，在NaCl濃度為0-4%的條件下，AK5均有較好的柴油降解率。其中不含NaCl條件下AK5的柴油降解率在62%，3% NaCl濃度下AK5的柴油降解率達95.6%，但在NaCl濃度為5%時，柴油降解率降到48%，因此AK5的最適生長的海水NaCl濃度為3%-4%，其最高耐受范圍是4%，適應自然海洋環境水體中的NaCl濃度。

2.4 不同柴油濃度下AK5的柴油降解率

分別在不同初始柴油濃度下研究柴油降解率，結果（圖4）表明，AK5菌株的柴油降解率隨著柴油濃度升高而降低，柴油濃度為5 g/L時柴油的降解率最高，第1天降解率就在42.5%，第7天降解率為99%。柴油濃度為20 g/L時，AK5的柴油7 d降解率也能達到將近60%。而AK5對質量濃度為5 g/L的柴油3 d降解率即超過60%。因此認為AK5能更好地適用于降解高濃度柴油污染水體。

2.5 在不同培養基條件下AK5的柴油降解情況

分別將AK5按照10%的接種體積，接種到無機鹽培養基和人工海水培養基中，柴油初始濃度為5 g/L。每天取樣，檢測其不同培養基培養條件下的柴油降解率，結果（圖5）表明，AK5在上述兩種培養基中均生長良好，在培養前4 d中，AK5在無機鹽培養基中的柴油降解率要高于海水培養基，培養1 d后，無機鹽培養基中柴油降解率為50%以上，而人工海水培養基為40%，但是第6、7天，在兩種培養基中的柴油降解率趨于一致，在培養7 d后柴油降解率均達到99%。由此可見，AK5在淡水及海水環境下均生長良好并能夠保持較高的柴油降解率，因此可以用于淡水水體和海洋水體的柴油生物處理。

3 討論

生物技術修復是海洋受到石油烴污染后采用的一種主要修復手段，而其中最關鍵的環節就是獲得具有高效降解活性的降解微生物。目前已知海洋中最主要的石油烴降解細菌有：無色桿菌屬（Achromobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、產堿桿菌屬（Alcaligenes）等。近年來國內分離到的海洋石油烴降解菌有：劉陳立等［21］分離得到的食烷菌（Alcanivoraxsp. B-5）；陳碧娥等［22］從湄洲灣污染水樣中分離得到的假單胞菌（Pseudomonassp. H1），譚田豐等［23］從勝利油田黃河碼頭近岸表層海水分離得到的不動桿菌（Acinetobactersp. PN3-2）和蘇瑩［24］分離到的不動桿菌（Acinetobactersp. HB-1）和周常義［25］的Acinetobactersp. JMUXMS-100等。

從已經報道的柴油降解菌的種屬分布來看，它們可以分布在廣泛的種屬中，但是以Acinetobacter居多，本研究分離得到的菌株也屬Acinetobacter，但是與其他研究不同的是，本研究獲得菌種的來源并非從受到石油烴污染的海洋環境中獲得，而是從城市生活污水處理廠活性污泥中分離得到，這說明石油烴類降解菌分布廣泛，具有很強的適應性。柴油降解菌的生長條件和降解能力對后續的應用非常重要，因此本試驗進一步研究了其生長條件和降解特性。從初始pH和NaCl濃度來看，AK5主要是在中性偏堿性的條件下生長較佳，這與其他研究者分離得到的柴油降解菌生長條件類似。在NaCl濃度為0-4%的條件下，AK5均有較好的柴油降解率，但是從降解率曲線可以看出，AK5在NaCl濃度為3%-4%條件下，其柴油降解率（95.6%）反而高于在不含NaCl條件下的降解率（62%），說明該菌非常適合海洋環境（鹽分含量約3.5%）下應用。

有關AK5降解能力的結果表明，其降解能力優良，在已經報道的一些菌屬中，降解效果較佳，表1列出了一些公開報道的柴油降解菌的降解條件和性能。此外，AK5在人工海水培養基和普通的無機鹽培養基中，均具有較好的柴油降解能力，說明該菌種適合于淡水和海水條件下的應用。

4 結論

本研究從污水處理廠的活性污泥中篩選出一株高效柴油降解菌，經鑒定為不動桿菌，Acinetobactersp. AK5。AK5在人工海水培養基條件下，在pH5-9時，NaCl濃度0-4%，柴油濃度5-20 g/L的條件下均能高效降解柴油。其中柴油濃度為20 g/L時7 d柴油降解率仍可達67%，優于已報道的海洋微生物。AK5在無機鹽培養基及人工模擬海水培養基中均生長良好，在淡水水體及海水水體中的石油烴污染處理中均有良好的應用前景。

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（責任編輯 馬鑫）

Isolation of Diesel Degrading Strain Acinetobacter sp. AK5 and Its Degrading Performance

Xu Xiaoyu Chen Jinghua
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122）

A diesel degradable bacterial strain was isolated from activated sludge and identified asAcinetobactersp. AK5 through physiological, biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis. Experiments of the different pH values, NaCl concentrations, culture time and diesel concentrations were detected to evaluate the diesel degradability byAcinetobactersp. AK5. The results show that the optimal initial pH scope for the bacterial growth is from 5 to 9, the optimum NaCl concentrations is between 3% and 4%. When the diesel concentration is 5 g/L, the 7 d diesel degradation rate can reach 99%, while when the concentration of diesel is 20 g/L, 7 d diesel degradation rate can be 67%. TheAcinetobactersp. AK5 can grow well in artificial seawater medium and inorganic salt culture medium, therefore it has promising application prospect in seawater and freshwater oil pollution treatment.

Diesel Degradation Acinetobacter Degradation rate

2014-01-07

江蘇省自然科學基金面上項目（BK2012557）

徐曉宇，女，碩士，研究方向：環境微生物；E-mail：iist@jiangnan.edu.cn