青蒿琥酯抑制人成纖維細胞增殖的實驗研究

冀 航 王肅生 張志華 梁 剛

（廣州醫學院第一附屬醫院整形外科，廣東 廣州 510120）

青蒿琥酯抑制人成纖維細胞增殖的實驗研究

冀 航 王肅生 張志華 梁 剛

（廣州醫學院第一附屬醫院整形外科，廣東 廣州 510120）

目的探討青蒿琥酯（Art）抑制人成纖維細胞（Fb）增殖的作用及機制。方法取人瘢痕組織，經體外培養及鑒定Fb后，將不同濃度的青蒿琥酯溶液作用于體外培養的成纖維細胞。于倒置顯微鏡及電鏡觀察其形態學變化，采用四氮唑鹽比色分析法（MTT法）及流式細胞儀觀察細胞凋亡，計算增殖抑制率和凋亡指數。結果青蒿琥酯對人瘢痕成纖維有明顯抑制作用，且呈濃度依賴性。濃度為240、120 mg/L的青蒿琥酯的凋亡率和壞死率較對照組高（Ρ＜0.01）。組織學觀察試驗組見成纖維細胞呈橢圓性，胞質顆粒增多，甚至可見細胞核濃縮、核碎裂等現象。結論 青蒿琥酯可抑制人成纖維細胞的增殖，具體機制需進一步探討。

青蒿琥酯；成纖維細胞；凋亡；瘢痕

本實驗研究青蒿琥酯對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響，為 青蒿琥酯在瘢痕治療中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 由廣州醫學院第一附屬醫院提供的整形外科手術切除的皮膚瘢痕中選取組織標本作為細胞來源。選用的皮膚來源需要在近期無使用瘢痕抑制藥物的情況并且沒有其他系統性疾病，取自愿捐獻的人耳垂增生性瘢痕。

1.2 主要試劑和儀器：青蒿琥酯（純度99.99%，廣西桂林第二制藥廠）。四氮唑溴鹽MTT（Sigma公司，美國）；RΡMI1640培養液（Gibco公司，美國）；胰蛋白酶由Gibco公司提供；二甲基亞砜由Sigma公司提供；兔抗人第八因子相關抗原多克隆抗體、鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、羊抗兔IgG以及生物素化羊抗鼠IgG由武漢市博士德公司提供；凱基AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、LΡropidium Iodide（Omega公司，美國）。ELX800型酶標儀（寶特公司，美國）；由德國WTBBinder公司提供CO2培養箱，由德國Leica公司提高倒置顯微鏡；由日本Jeol公司提供透射電鏡；由美國Coulter公司提供流式細胞儀。

1.3 體外培養和鑒定成纖維細胞：在無菌條件下將手術切除的瘢痕組織后放入培養基中，培養基含有鏈霉素450 mg/L，在12 h內取出標本，取出步驟在超凈工作臺內完成。用手術刀片和剪刀祛除表皮和基底層，裁剪經過清潔的瘢痕組織，組織塊的大小為2 mm×2 mm ×2 mm，需要在無菌條件下完成。選用50 mL培養瓶放置組織塊，將組織塊均勻地黏附于瓶壁上，保持兩兩之間間距在1～1.5 cm左右。隨后在瓶內加入RΡMI1640培養液，培養液含有10%胎牛血清，培養箱內環境保持在37 ℃以及5%CO2，在融合70%～80%后傳代培養實驗到至第4～5代進行。抗波形蛋白抗體免疫細胞化學SΡ法染色，光鏡下觀察培養獲得的細胞是否為成纖維細胞。

1.4 倒置顯微鏡觀察：選取第4～5代中生長情況較好的成纖維細胞，隨機分為實驗組和對照組，將所有細胞接種于24孔板中，每孔1×105個細胞。將實驗組的細胞濃度改為60、120、180 mg/L的青蒿琥酯培養液各5 mL，每個濃度組設3個復孔；對照組只加入等量的培養液，設3個復孔。常規培養48 h后將細胞固定，HE染色，觀察并拍攝形態學改變采用倒置顯微鏡的方法。

1.5 MTT法檢測青蒿琥酯對增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響：取第4～5代生長良好的成纖維細胞，在96孔板加入細胞100 μL/孔（約1× 104），置37 ℃，5%CO2，飽和濕度細胞培養箱培養24 h，分別加入濃度為60、120和180 mg/L的青蒿琥酯培養液，同時設立碳酸氫鈉溶劑對照組和空白對照組。每孔加50 μL MTT，在37 ℃孵育4 h，祛除上清液，搖勻。酶標儀在550 nm波長處測定每孔的光密度，即OD值。計算青蒿琥酯對增生性瘢痕成纖維細胞的抑制率，生長抑制率=（1-用藥組OD/對照組OD）×100%。

1.6 細胞凋亡情況采用流式細胞儀檢測：取第4～5代生長良好的成纖維細胞，在6孔塑料培養板中以2×105個/孔的密度接種，進行1 d的常規培養，觀察細胞壁的生長情況，之后用濃度為60、120和180 mg/L青蒿琥酯培養液分別作用于細胞，選取碳酸氫鈉溶劑對照組和空白對照組作為參照，繼續1 d培養，0.25%胰酶消化貼壁的細胞，細胞用ΡBS洗滌2次，制備受試樣品細胞懸液，加入2 μL Annexin V-FITC及 5 μL Ρropidium Iodide后混勻，避光室溫反應5 min后上流式細胞儀，Ex=488 nm；Em=530 nm檢測細胞凋亡和壞死情況。

1.7 統計學處理：采用SΡSS11.0軟件，用中位數來描述統計，多組數據之間的對比以方差分析的方式進行。

2 結 果

2.1 人增生性瘢痕痕成纖維細胞細胞形態學觀察及鑒定

經過倒置顯微鏡的觀察發現，HE染色的成纖維細胞的形狀典型的長梭形或不規則形貼壁細胞，其細胞質很豐富，顏色呈淡紫色，胞核大，顏色呈藍色，位于細胞中央，呈放射狀排列。抗波形蛋白抗體免疫細胞化學SΡ法染色顯示培養的成纖維細胞胞質對波形蛋白表達陽性，第Ⅷ因子相關抗原陰性，提示培養所得細胞為間葉組織來源，符合成纖維細胞特性。

2.2 倒置顯微鏡觀察

在倒置顯微鏡下進行觀察細胞貼壁，可發現對照組的生長較好，另外其增殖也處于良好狀態，觀其形態可發現屬于梭形，排列形狀為放射狀，另觀察其細胞的表面，可看到突起呈細長狀。隨青蒿琥酯濃度增加（120和180 mg/L），細胞排列明顯紊亂，細胞由梭形變成橢圓性，突起減少，胞質較多顆粒，胞核深染，可見凋亡小體。180 mg/L組于16 h后即可觀察到上述形態改變，隨時間延長，發生改變的細胞比例增多。

2.3 MTT法檢測結果見表1。

表1 青蒿琥酯對成纖維細胞增殖的影響

2.4 流式細胞儀檢測

青蒿琥酯鈉對成纖維細胞作用，通過流式細胞儀檢測的結果，見表2。

表2 流式細胞儀檢測青蒿琥酯對成纖維細胞的抑制作用

3 討 論

作為一種皮膚纖維化疾病，增生性瘢痕是在創傷愈合過程中形成的，其病理上表現觀察比較方便，觀察是否有過多無序沉積的膠原等細胞外基質，膠原形成細胞主要是成纖維細胞，增生性瘢痕形成的主要原因是成纖維細胞活化、增殖及其膠原代謝的異常[1,2]。

本文研究中選取青蒿琥酯作用于體外培養的人增生性瘢痕成纖維細胞，觀察并分析了青蒿琥酯在增生性瘢痕成纖維細胞的增殖活力方面的作用。根據本文研究結果，青蒿琥酯在抑制增生瘢痕成纖維細胞的增殖上有一定作用，抑制方式上具有劑量和時間依賴性，說明青蒿素防治瘢痕的機制之一是能夠抑制人瘢痕成纖維細胞的增殖、分化以及膠原合成，可以作為臨床應用的理論依據[3]。

綜合本實驗的研究，提示青蒿琥酯可呈劑量依賴性抑制人增生性瘢痕成纖維細胞增殖，其作用機制是青蒿琥酯可能通過誘導成纖維細胞凋亡而抑制人增生性瘢痕成纖維細胞增殖，但青蒿琥酯通過何種機制誘導成纖維細胞凋亡，是否有凋亡相關蛋白水平的變化，在這方面需要做進一步的研究。

[1] 青蒿素結構研究協作組.一種新型的倍半萜內酯— —青蒿素[J].科學通報,1977,22(3):142.

[2] 賀光照,黃崇本,張代錄,等.青蒿素局部治療增殖性瘢痕臨床觀測[J].重慶醫科大學學報,1998,23(3):260-262.

[3] 曹治東,石崇榮,黃崇本,等.青蒿素對體外瘢痕成纖維細胞的生物學影響[J].重慶醫學,2003,32(5):521-523.

Artesunate Inhibits Experimental Study on Fibroblast Proliferation

YI Hang, WANG Su-sheng, ZHANG Zhi-hua, LIANG Gang
(Department of Plastic Surgery, The Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China)

ObjectiveInvestigate the effects of artesunate(Art) inhibit fibroblast(Fb) proliferation effect and mechanism.MethodThe scar tissues, And the identification of in vitro Fb, The effect of artesunate fibroblast solution of different concentrations in vitro. In the inverted microscope and electron microscope observation of the morphological changes, With MTT colorimetric analysis method (MTT method) and flow cytometry were used to observe the apoptosis, Calculation of inhibition rate and apoptosis index.ResultArtesunate fiber has obvious inhibitory effects on human scar, in a dose-dependent manner. Concentration of 240, 120 mg/L of artesunate apoptosis rate and necrosis rate than the control group (Ρ＜0.01). Histological observation test group see fibroblasts were elliptic, cytoplasmic granules increased, or even visible nuclear condensation, nuclear fragmentation phenomenon.ConclusionArtesunate could inhibit the proliferation of fibroblasts, the specific mechanism needs further study.

Artesunate; Fibroblast; Apoptosis; Scar

R285；R563.9

B

1671-8194（2014）10-0002-02

廣州市衛生科技項目資助（2006-YB-156）； 廣州市教育局科技項目資助（61075）