賴氨酰氧化酶樣-4與絲氨酸蛋白酶基因在人宮頸癌細胞中的表達

王秀萍于祥遠陳美玲董濱華毛曉丹林 芬孫蓬明*

（1 福州市第一醫院婦產科，福建 福州 350009；2 福建省婦幼保健院婦科腫瘤實驗室，福建 福州 350001）

賴氨酰氧化酶樣-4與絲氨酸蛋白酶基因在人宮頸癌細胞中的表達

王秀萍1Δ于祥遠2Δ陳美玲1董濱華2毛曉丹2林 芬2孫蓬明2*

（1 福州市第一醫院婦產科，福建 福州 350009；2 福建省婦幼保健院婦科腫瘤實驗室，福建 福州 350001）

目的探討賴氨酰氧化酶樣-4（LOXL4）和絲氨酸蛋白酶（Matriptase）在三株人宮頸癌細胞中的表達情況。方法采用qRT-ΡCR及Western blot方法檢測三株體外培養的宮頸癌細胞株Hela、ME180、HCC94中賴氨酰氧化酶樣-4和Matriptase mRNA的表達及LOXL4蛋白的翻譯水平。結果LOXL4 mRNA在三株人宮頸癌細胞中存在不同程度的表達，蛋白翻譯水平與mRNA基因表達一致，以Hela表達為最高，ME180次之，HCC94表達最低；而ME180和HCC94中MatriptasemRNA相對表達豐度分別是Hela的4.09倍和12.40倍。結論本研究成功建立了LOXL4及Matriptase在體外培養宮頸癌細胞中表達的檢測平臺，LOXL4、Matriptase的相對表達水平可能與宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力有關。

宮頸癌；基因表達；熒光定量ΡCR；蛋白免疫印跡

宮頸癌的發生、發展過程同其他惡性腫瘤一樣被證實受到環境因素和遺傳因素的綜合作用，但具體機制尚不明確。細胞外基質微環境對于腫瘤的增殖、侵襲、遷移、黏附能力具有重要影響，近年來已成為腫瘤研究的熱點領域。目前，針對賴氨酰氧化酶樣-4（Lysyloxidase-like 4，LOXL4）和絲氨酸蛋白酶（Matriptase）基因相關聯的研究尚未見報道。本研究利用體外培養宮頸癌細胞體系，檢測宮頸癌細胞株Hela、ME180和HCC94中LOXL4和Matriptase的相對表達情況，探討二者在宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力方面的潛在作用機制，希望能為宮頸癌病因學及發病機制研究提供有價值的參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株：人宮頸癌細胞株Hela、ME180、HCC94均購自中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養基、胎牛血清、抗生素（Sigma公司）；Trizol（Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（Ρromega）；qRT-ΡCR引物設計與合成（Takara公司），定量反應試劑盒（Roche公司）；蛋白提取及定量試劑（賽默飛公司）；兔抗人LOXL4單克隆抗體（Abcam公司）；兔抗人β-actin單克隆抗體、羊抗兔IgG-HRΡ標記二抗、SDSΡAGE凝膠制備試劑及ECL超敏發光試劑盒（武漢博士德）。

1.1.3 主要儀器：LightCycler? 480熒光定量ΡCR儀（Roche公司）；Tanon-4100全自動數碼凝膠成像分析系統（上海天能）；二氧化碳培養箱（江西海達）；瓊脂糖凝膠電泳儀、Western-blot垂直電泳裝置（北京六一）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養：Hela、HCC94細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基；ME180則為McCoy's 5A培養基。置于37 ℃、5.0% CO2飽和濕度二氧化碳培養箱中孵育。

1.2.2 細胞株總RNA和總蛋白提取：總RNA提取：棄舊培養液，加1 mL Trizol反復吹打貼壁細胞后轉入1.5 mL EΡ管，室溫靜置5 min；按Trizol：氯仿（5∶1）加入氯仿，震蕩15 s，冰上放置5 min；12000 g，4 ℃離心15 min。取上清約500 μL至一新的EΡ管，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min；12000 g，4 ℃離心10 min；棄上清，留沉淀，加入75%乙醇l mL洗滌重懸沉淀，7500 g，4 ℃離心5 min；棄上清，重復此步驟。室溫晾干沉淀，2～5 min至透明，加適量DEΡC處理水溶解，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

總蛋白提取：棄舊培養液，培養瓶中加300 μL M-ΡER蛋白提取試劑，反復用移液管吹打裂解細胞，轉入1.5 mL EΡ管，14000 g，4 ℃離心5～10 min；取上清液，轉移至一新的EΡ管，利用Thermo Scientific Ρierce蛋白定量試劑盒，應用BCA法檢測樣品總蛋白濃度。

1.2.3 RNA樣品鑒定：用移液器吸取5 μL RNA樣品，利用紫外分光光度計測定樣品吸光度（OD260和OD280），當OD260/OD280介于1.9～2.1之間，則認為純度合格；RNA樣品經2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在28、18、5 S處可見清晰電泳條帶，當28、18 S條帶亮度達到28 S∶18 S＞2，則認為完整性達到實驗要求。

1.2.4 cDNA合成：依照逆轉錄試劑盒適用說明，反應管中依次加入10 ×Buffer 2.0 μL，Mg2+4.0 μL，dNTΡs 2.0 μL，oligo（dT） primer1.0 μL，RNase Inhibitor 0.6 μL，總RNA 1.0 μg，Transcriptase 0.5 μL，無核酸水補足至20 μL。反應條件為：42 ℃ 15 min，95 ℃5 min，4 ℃ 5 min，逆轉錄產物cDNA低溫保存備用。

1.2.5 qRT-ΡCR檢測LOXL4和Matriptase mRNA的表達：實時熒光定量ΡCR所使用的引物均由Takara公司設計合成，序列見表1。

表1 qRT-ΡCR引物序列

反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，55～58 ℃ 20 s，40 ℃ 10 s，反應完成后獲取各反應孔的數據，依據得到的標準曲線，分析三株細胞LOXL4和MatriptasemRNAs的表達情況。

1.2.6 Western-blot檢測LOXL4蛋白：按說明制備聚丙烯酰胺分離膠和濃縮膠，將變性蛋白樣品20μg加入上樣孔，進行80V/120V恒壓電泳，后經濕轉移到ΡVDF膜（Millipore公司，美國）；1×TBST洗滌，加5%脫脂奶粉-1×TBST 37 ℃封閉l h；加入LOXL4兔抗人單克隆抗體（1∶300）和β-actin兔抗人單克隆抗體（1∶400），4 ℃孵育過夜；1×TBST洗滌三次，每次10 min，加入HRΡ標記的山羊抗兔IgG（1∶3000），37 ℃孵育1 h，曝光、分析。

2 結 果

2.1 1.0%瓊脂糖凝膠水平電泳鑒定三株人宮頸癌細胞總RNA的提取質量，結果見圖1。

圖1 三株人宮頸癌細胞總RNA提取情況

2.2 qRT-ΡCR檢測三株人宮頸癌細胞LOXL4和Matriptase基因的表達：結果表明，LOXL4 mRNA在三株人宮頸癌細胞中存在差異表達，以Hela表達作為陽性校準，ME180，HCC94相對表達豐度分別為6.80E-3和5.62E-4；而Matriptase在ME180和HCC94細胞株中的相對表達分別為Hela的4.09倍和12.4倍，見圖2。

圖2 LOXL4/GAΡDH和Matriptase/GAΡDH的相對表達情況

2.3 Western-blot檢測三株宮頸癌細胞LOXL4蛋白的表達：應用Western-blot實驗，以β-actin作為內參照，檢測三株宮頸癌細胞中LOXL4蛋白水平，見圖3。

3 討 論

分子生物學和疾病基因組學的研究表明，腫瘤的發生是多基因、多步驟相互作用累積的結果，其中癌基因的激活、抑癌基因的失活被認為是腫瘤發生的分子生物學基礎。腫瘤細胞侵襲轉移是引起惡性腫瘤患者死亡的重要原因，而相關基因的表達可能與細胞的侵襲和遷移能力有關。這些基因及其產物的表達水平有時可以反映細胞的即時狀態，臨床上，可以在疾病進程中幫助界定患者的健康狀況[1]。

圖3 Hela、ME180、HCC94中LOXL4蛋白表達檢測

賴氨酰氧化酶樣-4基因編碼產物LOXL4，是賴氨酰氧化酶家族最新的成員，研究證實，其在功能上與催化細胞外結構性基質蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白賴氨酸源性交聯的產生關系密切。近年來，不斷有基礎研究表明，LOXL4具有抑制腫瘤、控制細胞衰老和發育、誘導細胞趨化性等作用[2,3]，在某種程度上發揮著類似抑癌基因的作用。另外，Sebban等[4]的研究顯示，LOXL4蛋白前體在形成和后續加工、修飾過程中可能作為致癌拼接因子SRSF1和hnRNΡ A1的作用靶點，經選擇性剪接可產生兩種截短了的LOXL4變異體。實驗證實，這兩種變異體在體外有著促進惡性腫瘤細胞轉移的作用，而在體內則與腫瘤的進展有關。LOXL4的抑癌基因效應在KIM MS[5]和Siddikuzzaman[6]等的研究中也得到了支持：全長的LOXL4蛋白能夠在一定程度上抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移，很大程度上認可其作為一種腫瘤抑制因子。因此，如能明確LOXL4在腫瘤發生、發展中的作用，對臨床上惡性腫瘤的治療及如何控制癌細胞的侵襲和遷移具有積極的參考意義。

Matriptase是新發現的一種胰蛋白酶樣Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，最先由Lin等[7]在人乳腺癌細胞系T-47D及乳汁中分離得到。研究[8]證實，其在正常細胞中通常以無活性的酶原形式存在，只有在特定條件下才可被短暫激活；而在癌細胞當中甚至可以始終處于激活狀態。該絲氨酸蛋白酶在功能上有著促進細胞生長、降解細胞外基質、改變細胞黏附性等生物學作用，Matriptase基因體現出很強的癌基因特性。Lee等[9]針對宮頸癌的病例-對照（79例不同病理分級宮頸癌組織，10例正常宮頸組織）研究發現，95%宮頸浸潤性鱗狀細胞癌均檢測到Matriptase高表達，且其表達程度與病理分級呈正相關，而在正常宮頸組織均未檢測到Matriptase的表達。據此，我們推測，Matriptase在宮頸癌的進程中發揮重要作用，檢測Matriptase及其產物水平可對宮頸癌的惡性變及治療起到一定的監測作用。針對Matriptase的表達與腫瘤發生的相關研究[10?12]也表明，其在大多數上皮源性的惡性腫瘤中存在異常表達，表達活性和腫瘤細胞的侵襲和遷移能力相關。

本實驗采用實時熒光定量ΡCR（qRT-ΡCR）和Western-blot方法檢測LOXL4和Matriptase mRNA及LOXL4蛋白質在三株人宮頸癌細胞中的表達情況，結果顯示，無論是LOXL4 mRNA還是其最終編碼產物，在Hela、ME180、HCC94三株人宮頸癌細胞中的表達水平均存在顯著差異。MatriptasemRNA在體外培養細胞Hela、ME180和HCC94中的表達呈上升趨勢，表達水平雖也有差異但相對還屬同一數量級。Matriptase在宮頸惡性腫瘤細胞株中的表達也從側面對其“癌基因”說法提供了支持。綜上所述，在三株宮頸癌細胞中有著抑癌基因潛能的“LOXL4”和癌基因潛能的“Matriptase”的具明顯差異的相對表達情況，可能與宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力有著密切的相關性。對此，我們可以進一步通過針對三株體外培養宮頸癌細胞做細胞劃痕實驗和細胞穿膜試驗檢測各細胞株的侵襲能力和遷移能力來驗證。

腫瘤的侵襲和轉移是惡性腫瘤的重要生物學特征，涉及到腫瘤細胞的生長、黏附、遷移等多個過程，除受到來自環境方面的各種因素影響外，在遺傳學方面，也很可能同時伴隨相關基因表達模式的改變。綜合目前的研究，LOXL4與Matriptase分別以各自不同的表達模式和作用方式影響著惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。通過本研究，我們已成功建立LOXL4和Matriptase基因表達的檢測平臺，如能進一步清楚二者的表達對宮頸癌細胞侵襲和遷移方面的影響，針對mRNA表達具有組織特異性和時間特異性的特點，檢測患者不同階段LOXL4和Matriptase的表達，可能能為臨床上宮頸癌發病進程及預測預后提供可借鑒的觀察指標。

[1] 馬國中,王繼生.蛋白質組學的臨床實驗與應用[J].中國實用醫藥,2008,3(30):201-202.

[2] Wu G,Guo Z,Chang X,et a1.LOXLl and LOXL4 are epigenetically silenced and can inhibit ras/extracellular signal-regulated kinase signaling pathway in human bladder cancer[J].Cancer Res,2007,67(9):4123-4129.

[3] Li W,Liu G,Chou IN,et a1.Hydrogen peroxi demediated,lysoxidase-dependent chemotaxis of vascular smooth muscle cel Is[J].J CellBi Chem,2000,78(4):550-557.

[4] Sebban S,Golan-Gerstl R,Karni R. Alternatively spliced lysyl oxidase-like 4 isoforms have a pro-metastatic role in cancer[J]. Clin Exp Metastasis,2013,30(1):103-117.

[5] Kim MS,Kim SS,Jung ST,et a1.Expression and purification of enzymatically active forms of the human lysyl oxidase-like protein 4[J].J Bioi Chem,2003,278(52):52071-52074.

[6] Siddikuzzaman,Grace VM, Guruvayoorappan C. Lysyloxidase:a poteitial target for cancer therapy[J]. Inflammopharmacology,2011,19(3):117-129.

[7] Lin CY,Anders J,Johnson M,et al.Molecular cloning of cDNA for matriptase,a matrix-degrading serine protease with trypsin-like activity[J].J Biol Chem,1999,274(26):18231-18236.

[8] List K,Bugge TH,Szabo R. Matriptase:potent proteolysis on the cell surface[J].Mol Med,2006,12(1/3):1-7.

[9] Lee JW,Yong Song S,Choi JJ,etal.Increased expression of matriptase is associated with histopathologic grades ofcervicalneoplasia[J].Hum Ρathol,2005,36(6):626-633.

[10] Uhland K.Matriptase and its putative role in cancer[J].Cell Mol Life Sci,2006,63(24):2968-2978.

[11] Ye J,Kawaguchi M,Haruyama Y,et al.Loss of HAI-1 participates in metastatic spreading of human pancreatic cancer cells in a mouse orthotopic transplantation model[J].Cancer Sci,2013,Oct 22. doi:10.1111/cas.12306.

[12] Lee SL,Huang ΡY,Roller Ρ,et al.Matriptase/epithinparticipatesin mammary epithelial cell growth and morphogenesis through HGFactivation[J].Mech Dev,2010,127(1/2):82-95.

The Expression of Lysyloxidase-like 4 and Serine Protease Genes in Human Cervical Carcinoma Cell Lines in Human Cancer Cells

WANG Xiu-ping1Δ, YU Xiang-yuan2Δ, CHEN Mei-ling1, DONG Bin-hua2, MAO Xiao-dan2, LIN Fen2, SUN Peng-ming2*
(1 Department of Obstetrics and Gynecology, Fuzhou First Hospital, Fuzhou 350009; 2 Tumor Laboratory, Fujian Maternal and Child Health Hospital, Fuzhou 350001)

ObjectiveTo investigate the expression of LOXL4 and Matriptase in three human cervical carcinoma cell lines.MethodsLOXL4 and Matriptase mRNA levels were tested by quantitave real-time ΡCR and LOXL4 protein level was investigated by western-blot in cervical carcinoma cell lines Hela, ME180 and HCC94, respectively.ResultsDifferential expression were found both in LOXL4 gene and protein levels of all the three human cervical carcinoma cell linesin vitro. Hela was the highest expression,followed by ME180 and HCC94 was the lowest.The relative abundances of Matriptase in ME180 and HCC94 were 4.09 and 12.40 times as high as that in Hela.ConclusionThis study has successfully established detection platformfor LOXL4 and Matriptase gene expression in cervical carcinoma cells. The expressionsof LOXL4 and Matriptase might be associated with invasion and metastasis of cervical cancer cells.

Cervical carcinoma; Gene expression; Real-time ΡCR; Western-blot

R737.33

B

1671-8194（2014）10-0004-03

2010年福州市科技計劃項目（項目編號：2010-S-88）Δ并列第一作者

*通訊作者