化瘀通絡(luò)健盤貼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

孟 燦 陳隨清 張培培

（河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

化瘀通絡(luò)健盤貼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

孟 燦 陳隨清 張培培

（河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

目的制定化瘀通絡(luò)健盤貼的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜（TLC）法對處方中乳香、沒藥和血竭進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜（HΡLC）法對血竭中的血竭素進(jìn)行含量測定。結(jié)果薄層色譜專屬性強(qiáng)、斑點(diǎn)清晰、分離度好；血竭素進(jìn)樣量在0.130～0.455 μg范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，回歸方程為：Y=5557853187X-49712，r=0.9997；加樣回收率平均值為98.49%，RSD為1.61%（n=6）。結(jié)論該方法簡便、檢測靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于化瘀通絡(luò)健盤貼的質(zhì)量控制。

化瘀通絡(luò)健盤貼；薄層色譜鑒別；高效液相色譜法；血竭素；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

化瘀通絡(luò)健盤貼主要由乳香、沒藥、血竭、青風(fēng)藤、麻黃、全蟲、細(xì)辛、千年健、獨(dú)活等13味藥材組成，具有補(bǔ)腎健骨、行氣活血、通絡(luò)止痛之功效，臨床用于治療頸、腰椎間盤突出癥等引起的頸、腰以及上下肢疼痛麻木等。為了進(jìn)一步控制化瘀通絡(luò)健盤貼的質(zhì)量，確保臨床用藥安全有效，本文采用薄層色譜法對處方中血竭、乳香、沒藥3味藥材進(jìn)行定性鑒別，并以血竭中的血竭素作為定量指標(biāo)，采用HΡLC法進(jìn)行含量測定，為有效的控制該貼劑的質(zhì)量提供科學(xué)合理的依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

水浴鍋DK-S26（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），十萬分之一分析天平BT25S（賽多利思科學(xué)儀器），高效液相色譜儀e2695-2998（美國waters公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG-9053A （上海市醫(yī)用恒溫設(shè)備廠），高速粉碎機(jī)XIA-100A（姜堰市銀河儀器廠），循環(huán)水式多用真空泵SHZ-95B（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），自動(dòng)雙重純水蒸餾器SZ-93（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

血竭素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110811-200704）；化瘀通絡(luò)健盤貼及相應(yīng)陰性樣品均由河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院提供；實(shí)驗(yàn)中所用藥材均于鄭州市張仲景大藥房購買，由河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定全部符合2010版《中國藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定；硅膠GF254（上海亨代勞商貿(mào)有限公司），乙腈（色譜純），雙蒸水，其余所用試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 乳香的薄層鑒別：取本品3.0 g，置具塞錐形瓶中，加正己烷10 mL，超聲震蕩15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。按處方配比和制法，制備缺乳香的陰性樣品，按照供試品制備方法制得乳香陰性對照樣品溶液。另取乳香對照藥材0.2 g，置具塞錐形瓶中，加正己烷10 mL，超聲震蕩（功率：250 W，頻率100 kHz）15 min，過濾后濾液作為對照藥材溶液。吸取供試品溶液、陰性對照樣品溶液、對照藥材溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，展開劑為石油醚—乙酸乙酯（5∶1），展開后取出，晾干，以5%茴香醛硫酸溶液為顯色劑，100 ℃加熱10 min至斑點(diǎn)顯色清晰。最后，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光黃斑點(diǎn)，而陰性對照樣品色譜在與供試品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上無對應(yīng)斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 乳香薄層色譜照片及色譜圖

2.1.2 沒藥的薄層鑒別： 取本品6.5 g，置具塞錐形瓶中，加入40 mL乙醇溶解，超聲震蕩（功率：250 W，頻率100 kHz）30 min，過濾后將濾液蒸干，加2 mL乙醇溶解殘?jiān)鳛楣┰嚻啡芤骸０刺幏脚浔群椭品ǎ苽淙睕]藥的陰性對照樣品，同法制備陰性對照樣品溶液。再取沒藥對照藥材0.4 g，置具塞錐形瓶中，按照供試品制備方法制得沒藥對照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2010版一部附錄ⅥB）[1]試驗(yàn)，吸取供試品和陰性對照樣品溶液各4 μL以及對照藥材溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，層析條件為三氯甲烷—乙酸乙酯（80∶1），展開后取出，晾干，以5%茴香醛硫酸溶液為顯色劑，105 ℃加熱10 min至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫紅色斑點(diǎn)，而陰性對照樣品色譜在與供試品色譜和對照藥材色譜相應(yīng)的位置上無對應(yīng)斑點(diǎn)。見圖2。

2.1.3 血竭的薄層鑒別：取本品2.0 g，加入10 mL乙醚，密塞并振搖10 min，過濾后將濾液作為供試品溶液。按處方配比和制作工藝，制備缺血竭的陰性樣品，按照供試品制備方法制得陰性對照樣品溶液。另取血竭對照藥材0.1 g，同法制得血竭對照藥材溶液。再取血竭素高氯酸鹽對照品加甲醇制成每1 mL中含血竭素26 μg （血竭素重量等于血竭素高氯酸鹽重量/1.377）的對照品溶液。吸取上述4種溶液各15 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，層析條件為三氯甲烷-甲醇（19∶1），展開后取出，晾干，置日光燈下觀察。結(jié)果，在與對照品和對照藥材溶液相對應(yīng)的位置上，供試品溶液顯相同的橙色斑點(diǎn)，且陰性對照樣品無干擾。見圖3。

圖2 沒藥薄層色譜照片及色譜圖

圖3 血竭薄層色譜照片及色譜圖

2.2 HΡLC法測定血竭素的含量

2.2.1 色譜條件：色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：乙腈—0.05 moL/L磷酸二氫鈉溶液（52∶48）；檢測波長：440 nm；流速：0.8 mL/min；柱溫：38 ℃；進(jìn)樣量：10 μL，在上述色譜條件下，血竭素與其他成分色譜峰分離度良好，陰性樣品無干擾。理論塔板數(shù)按血竭素峰計(jì)算不低于4000。結(jié)果見圖4。

圖4 化瘀通絡(luò)健盤貼中血竭素的HΡLC圖

2.2.2 供試品溶液的制備：取本品適量，除去蓋襯，剪成小塊，取0.15 g，精密稱定，置具塞試管中，精密移取10 mL 3%磷酸甲醇溶液，密塞并振搖3 min，過濾后精密量取續(xù)濾液1 mL，加甲醇溶液定容至5 mL棕色量瓶，搖勻，即得。

2.2.3 對照品溶液的制備：精密稱取減壓（五氧化二磷）干燥24 h的血竭素高氯酸鹽對照品1.8 mg，加3%磷酸甲醇溶液定容至10 mL棕色量瓶，搖勻，精密移取1 mL，加甲醇溶液定容至5 mL棕色量瓶，搖勻，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備[2,3]：按處方的配比和制法，制備缺血竭的陰性對照樣品，精密稱定，照供試品溶液的制備方法制成陰性對照溶液。

2.2.5 線性關(guān)系考察：精密吸取血竭素高氯酸鹽對照品溶液（0.026 mg/mL）5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μL進(jìn)樣，橫坐標(biāo)：進(jìn)樣量（x，μg），縱坐標(biāo)：峰面積積分值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程為Y=5557853187X-49712（r =0.9997）。結(jié)果表明，血竭素進(jìn)樣量在0.130～0.455 μg范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，見圖5。

圖5 血竭素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.6 精密度試驗(yàn)：精密吸取對照品溶液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到血竭素峰面積的RSD為2.38%，表明儀器具有良好的精密度。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別按照“2.2.1”項(xiàng)下條件于0、2、4、6、8、10、14 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD為2.74%＜3%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品適量，共5份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述色譜條件分別進(jìn)樣測定。計(jì)算其峰面積的RSD=1.36%，表明所建立的方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)：稱取已知血竭素含量的同一批樣品適量，共6份，精密稱定，加入質(zhì)量濃度為0.026 mg/mL的血竭素高氯酸鹽對照品5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下的方法制備所需供試品溶液，分別按照“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果求得血竭素平均加樣回收率為98.49%，RSD=1.61%。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 樣品含量測定：取5批化瘀通絡(luò)健盤貼樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣測定峰面積，用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算血竭素含量。結(jié)果見表2。

3 討 論

由于該處方有13味藥材組成，藥味較多，采用薄層色譜法對貼劑中各味藥材分別進(jìn)行了定性鑒別，但因?yàn)殛幮愿蓴_較為明顯，處理方法相對復(fù)雜，所以只對乳香、沒藥、血竭3味藥材進(jìn)行的薄層色譜鑒別，并且其分離度好、重現(xiàn)性強(qiáng)、陰性無干擾，故采用本文的方法對該方中此3種藥材進(jìn)行薄層鑒別。

處方中血竭為化瘀通絡(luò)健盤貼的君藥，故對血竭中的血竭素進(jìn)行含量測定。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)HΡLC法測定血竭中血竭素的含量通常采用不同比例的乙腈-0.05 moL/L磷酸二氫鈉溶液為流動(dòng)相[4,5]，故本試驗(yàn)對流動(dòng)相的配比進(jìn)行了考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙腈—0.05 moL/L磷酸二氫鈉溶液（52∶48）為流動(dòng)相時(shí)，峰分離效果最好，峰面積最大，保留時(shí)間最短，且峰形較好。此外，根據(jù)藥典對單味藥血竭的檢測，采用440 nm作為檢測波長，結(jié)合3D色譜圖，發(fā)現(xiàn)在440 nm時(shí)，峰分離度好，且峰形對稱，故選其為最佳波長。綜上，本文所建標(biāo)準(zhǔn)能夠有效控制本品質(zhì)量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:554-556.

[2] 王杰,吳貴華,呂曙華.HΡLC法測定紅花七厘散中血竭素高氯酸鹽[J].中草藥,2006,37(6):859-860.

[3] 張斌,王麗娜,麻風(fēng)華,等.高效液相色譜法測定骨復(fù)康膠囊中血竭素的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2003,9(3):16-17.

[4] 李長達(dá).安陽固本膏中血竭素的HΡLC含量測定[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2012,6(19):119.

[5] 張曉燕,劉敏臣,高菲,等.HΡLC法測定血竭膠囊中血竭素的含量[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊,2009,11(2):297.

Quality Standard Research of Huayu Tongluo Jianpan Stickers

MENG Can, CHEN Sui-qing, ZHANG Pei-pei
(Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)

ObjectiveTo formulate Huayu Tongluo Jianpan Stickers to the quality control stan-dards.MethodsTo use thin layer chromatography to identify the Frankincense、Myrrh and Dragon's blood. Use high performance liquid chromatography method for the determination of dr-acorhodin content.ResultsThe TLC is a feasible method with strong specificity, TLC spots were clear and good separation;Dracorhodinin 0.130～0.455 μg has a good linear relationship. The regression equation is Y=6E+09X-49712, r =0.9997. Average sample recovery rate was 98.49%, RSD was 1.61%(n=6).ConclusionThe method is simple, high detection sensitivity,good reproducibility,and can be used for quality control of Huayu Tongluo Jianpan Stickers.

Huayu Tongluo Jianpan Stickers; TLC; HΡLC; Dracorhodin; Quality standard

R284.1

B

1671-8194（2014）10-0008-03

河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號：114200510014）

*通訊作者:E-mail: suiqingchen@sohu.com