小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發和室內人工接種方法的探索

姚 卓， 陳萬權， 高 利， 劉太國， 劉 博

（中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

小麥矮腥黑粉菌冬孢子萌發和室內人工接種方法的探索

姚 卓， 陳萬權*， 高 利， 劉太國， 劉 博

（中國農業科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

摘要小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK）引起的我國對外一類檢疫性病害。本項研究對其病菌冬孢子的萌發、人工接種方法進行了室內試驗。結果表明，參試菌株冬孢子在土壤浸提液培養基上45～50 d時達到萌發高峰，冬孢子濃度對萌發率有影響，濃度為（100～105）×104個／m L時萌發率最高。因此，可以選用此濃度作為室內TCK冬孢子萌發研究的適宜濃度。在室內進行TCK冬孢子的人工接種方法的研究表明，冬孢子在培養基上萌發后，將麥種放在培養皿蓋中的濕濾紙上，置于5℃的培養箱中培養，直到苗長到3～5 cm，然后將麥苗種植到直徑為24 cm的塑料盆中，在白天30℃，夜晚18℃的生長箱中培養至植株成熟，可獲得7%左右的發病植株。

關鍵詞小麥矮腥黑粉菌； 冬孢子萌發； 人工接種試驗

小麥矮腥黑穗病是由小麥矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn，TCK）引起的重要國際檢疫性病害，也是我國對外檢疫的一類危險性植物病害。該病害危害大、防治難，一旦傳入會給小麥生產帶來毀滅性危害，通常發病率約等于小麥產量損失率［1-2］。據Hoffmann報告，在流行年份，因TCK引起的損失率一般為20%～50%，最高可達75%～90%［3］。除了產量損失外，被侵染的小麥出粉率也會隨著感染嚴重程度而降低，并且因含有TCK冬孢子而極大地影響品質。1935年Young［4］根據小麥矮腥黑穗病病株矮化明顯、分蘗多、病穗緊密及病粒硬等特征，將其與小麥普通腥黑穗病區分開。目前該病害已在歐洲、北美、南美、大洋洲、亞洲、非洲等約49個國家發生。這些發病地點均在北緯30°和南緯30°以上的中緯度地區。TCK的寄主范圍很廣，危害小麥、大麥、黑麥等禾本科18個屬的70多種植物，其中，對小麥危害最嚴重［5］。該病在栽培條件下的主要寄主為冬小麥，我國常年小麥種植面積約2 300萬hm2，其中冬小麥占絕大部分，隨著我國加入WTO及與TCK疫區國家美國小麥貿易的增加，TCK傳入我國的可能性日益增大。目前國內關于小麥矮腥黑粉菌在室內條件下完成侵染循環過程的研究較少，不能明確小麥矮腥黑穗病病害循環過程中各階段的環境條件。探索小麥矮腥黑粉菌的室內人工接種方法，并完成病菌的侵染循環過程，將有助于在室內隔離條件下進行小麥矮腥黑粉菌生物學研究，包括病菌不同小種的致病性、小麥品種抗病性研究等，防止在室外條件下進行研究時出現病菌擴散的情況，造成嚴重后果，進而從各方面加強對該病的防治。

1 材料與方法

1.1 TCK冬孢子濃度對萌發的影響

供試菌株為2011年從口岸截獲的小麥矮腥黑粉菌。小麥矮腥黑粉菌冬孢子的表面消毒處理和萌發參照王吉霞等的方法［6］。從病穗中取1粒菌癭，置于2 m L離心管中，加入適量蒸餾水浸泡菌癭，靜置30 min，然后將菌癭搗碎并充分振蕩，用150目網篩過濾后，將濾液放在室溫下培養24 h，低速離心后棄去上清液，加0.25%NaCl O水溶液并在室溫下放置1 min進行表面消毒，用滅菌水洗3次，利用血球計數板將冬孢子在滅菌水中調至不同濃度：（5～10）×104、（25～30）×104、（50～55）×104、（75～80）×104、（100～105）×104、（125～130）×104、（150～155）×104、（175～180）×104個／m L。

將配制好的冬孢子懸浮液加入預先做好的土壤浸提液培養基平板（1 000 m L培養基中含有20 g瓊脂、5 mg 80萬IU青霉素、75 g土壤）上，每皿加冬孢子懸浮液0.25 m L，并用無菌三角玻璃棒均勻涂抹培養基表面，每個濃度重復3次。用封口膜封好后倒置放于5℃的光照培養箱中培養，光照強度為600 lx。

從培養15 d之后開始，每5 d鏡檢觀察1次，每個培養皿觀察400個孢子。以先菌絲長到冬孢子直徑的1／2時視為萌發，記錄萌發起始時間、萌發數目及生長情況。

1.2 TCK的室內人工接種方法研究

供試菌株同上。接種寄主：‘東選3號’。接種前，將小麥種子用30%NaOCl水溶液表面消毒5 min，無菌水沖洗3次，以便殺死種子表面可能攜帶的TCK和小麥網腥黑粉菌孢子。然后將小麥種子浸種催芽，待胚芽鞘長度為1～3 mm時備用。

接種方法一：小麥在接種前需經過春化處理，春化溫度為4℃，春化時間約4周。當約70%的冬孢子萌發時，在每個土壤浸提液培養基中放入4～5 g種子和5 m L冷水（約5℃），用消毒過的玻璃棒混合，直到種子濕潤并均勻覆蓋病菌。接種必須在擔孢子開始解體前進行，單個擔孢子有泡則表明已解體。將接種后的種子播于直徑24 cm塑料盆中，深度約5 cm，每盆種10粒種子。在10℃下培養，直到幼苗出土良好，時間約2周。然后將幼苗移至高溫室中培養，白天溫度約25℃，夜間溫度約13℃，進行常規管理，將植株種植至成熟。

接種方法二：將接有冬孢子懸浮液的小麥種子（同方法一）播種在直徑11 cm塑料盆的潮濕蛭石中，播種深度為5 cm，然后用一層鋁箔覆蓋，放在10℃下培養2周左右。然后將幼苗移到盛有滅菌土的直徑為24 cm的塑料盆中，每盆約10株，置5～10℃下至少8周，進行春化處理，然后將植株放在白天30℃，夜晚18℃的人工氣候培養箱中種植至植株成熟［7］。

接種方法三：將種子放在培養皿蓋中的濕濾紙上，然后將皿底盛有一層承載萌發孢子的土壤浸提液培養基倒置過來，使培養基上承載萌發冬孢子的一面與小麥種子接觸，放在5℃的培養箱中培育，并可通過這段時間的低溫對小麥進行春化處理，直到苗長到3～5 cm。然后將幼苗種植到直徑為24 cm的塑料盆中，放在白天30℃，夜晚18℃的人工氣候培養箱中種植至植株成熟［8］。

接種方法四：將小麥種子壓入培養基中，TCK冬孢子在培養基表面進行萌發，把種子的胚并列對著孢子。小麥萌發時改變培養基的位置，使胚芽鞘能沿培養基表面生長。接種后，將培養皿放置在10℃的生長箱中，直到麥苗的胚芽鞘長到3～5 cm。然后將麥苗種植到盛有滅菌土的直徑為24 cm的塑料盆中，放在白天30℃，夜晚18℃的人工氣候培養箱中種植至植株成熟［8］。

2 結果與分析

2.1 不同TCK冬孢子濃度對其萌發的影響

不同濃度下參試菌株冬孢子的萌發率變化如圖1所示。由圖1可以看出，TCK菌株冬孢子在最適溫度5℃下，不同冬孢子濃度下的菌株起始萌發時間最短為15～20 d，大部分菌株為25 d。通過對TCK冬孢子萌發過程的系統觀察發現，TCK冬孢子萌發后先長出先菌絲，在瓊脂培養基上，有的菌株先菌絲在產生初生擔孢子前大量生長，先菌絲長短差異較大（圖2a）。有的菌株可在冬孢子上觀察到多個萌發孔，在同一冬孢子上產生多條先菌絲（圖2b）。絲狀的初生擔孢子是從先菌絲頂部開始生長，形成密集的一束（圖2b），起初先菌絲沒有隔膜，正常萌發的冬孢子在培養35 d以后先菌絲一端開始產生隔膜，并可觀察到先菌絲的頂端長出初生擔孢子和冬孢子融合后形成的H體和接合釘（圖2c）。45 d左右開始有少量的初生擔孢子頂端長出臘腸狀的次生擔孢子（圖2d）。此結果與王吉霞［6］的結果基本一致，各階段孢子形態如圖2所示。

圖1 TCK不同冬孢子濃度對萌發的影響Fig.1 Effects of different concentrations of TCK teliospores on the germination rate

圖2 TCK冬孢子萌發過程中不同階段的形態（10×）Fig.2 Form of TCK teliospore germination at different stages（10×）

從圖1中還可以看出，不同濃度的參試菌株在45～50 d達到最高萌發率，約為60%～75%，與Meiners的研究結果一致［8］。利用SAS8.0進行方差分析結果表明，在45～50 d參試菌株在濃度達到（100～105）×104個／m L時，與高濃度參試菌株的萌發率差異達到顯著水平，隨著濃度的升高，萌發率差異不顯著（表1）。

2.2 室內人工接種方法的研究

采用不同方法進行人工接種后，對小麥不同生長時期病害癥狀進行系統觀察（圖3）。在小麥生長初期，病葉片上表現為微小、不清晰或清晰的黃斑和／或條紋（圖3f）。受侵染的植株易產生異常矮化分蘗，病穗的莖稈通常縮短。受侵染的小花未成熟子房呈深綠色，而健康的子房則呈淺綠色。發育完全的孢子團一般呈籽粒狀，但比正常籽粒圓且大，這使得內外稃張開，使病穗呈現特征形態（圖3g）。成熟孢子團由冬孢子組成并被薄而修飾過的子房壁包被（圖3i）。孢子團散發出與魚腥味相似的強烈氣味。病害一般僅在病株的某些分蘗中發生。在4種接種方法中，方法一和方法三分別獲得了3.33%和6.66%的發病麥穗。

表1 45 d和50 d時不同濃度下TCK冬孢子的萌發率1）Table 1 Germination rate of TCK teliospores under different concentrations after culture of 45 d and 50 d

圖3 TCK侵染循環示意圖Fig.3 Sketch map of TCK infection cycle

3 結論與討論

目前有關TCK冬孢子萌發的研究主要是其與環境因子之間的關系。王吉霞等研究了溫度對TCK冬孢子萌發的影響，試驗結果表明，TCK冬孢子萌發的溫度范圍為－2～12℃，其中5℃為萌發的最佳溫度［6］。賈文明等對土壤濕度對TCK冬孢子萌發的影響進行了研究，結果表明，TCK冬孢子在土壤質量含水量為1%～28%（相對含水量3.57%～100%）范圍內均可萌發，其適宜萌發的土壤含水量范圍為10%～25%（相對含水量17.85%～89.3%），最佳土壤相對含水量范圍在65%～75%之間［9］。江輝等研究了TCK不同菌株冬孢子萌發對溫度的敏感性，進一步明確不同菌株TCK冬孢子萌發對溫度的反應，菌株在相同的培養條件下，隨著保存年限的增長，冬孢子的萌發率會逐漸下降［10］。本試驗通過設計TCK冬孢子的濃度梯度，研究濃度與冬孢子萌發之間的相關性，試驗結果表明，不同濃度的TCK冬孢子對萌發有一定影響，冬孢子濃度在（100～105）×104個／m L以下時，其萌發率隨濃度增加逐漸升高。相關研究表明，腥黑粉菌具有魚腥味的化學物質三甲胺可抑制TCK冬孢子萌發［11］，其他冬孢子未知的內源化合物也能抑制萌發［12］，可能由于高濃度的自我抑制化合物而使殘存在孢子堆中的冬孢子不萌發［13］。在本試驗中，當濃度達到一定范圍時，冬孢子的萌發率反而逐漸降低，也證明了上述研究內容。因此，在人工接種試驗中，需要較高冬孢子萌發率，以確保病菌能夠侵入小麥體內，并在寄主體內進一步擴展，引起小麥發病，所以在冬孢子萌發試驗過程中，應通過選擇合適的冬孢子濃度，年代較近的菌株以及控制溫度和濕度等環境條件，以確保冬孢子有較高的萌發率。

國內關于TCK冬孢子人工接種試驗的相關研究較少，在大連、北京、天津等地室外采用將TCK冬孢子撒在土壤表面的接種方法得到了大量TCK病株（章正，王圓等，未發表資料）。易建平將接種萌發TCK冬孢子的小麥種子在5℃光照（12 h／d）條件下培養21 d或29 d后，移植于塑料周轉箱中，按照小麥常規田間管理措施管理，直到收獲，該試驗獲得了發病麥穗，這是單個萌發TCK冬孢子造成小麥發病的第一次報道［14］。但該試驗發病率較低，且將冬孢子接種小麥后移植到室外培養，環境條件可控性較差。本試驗在國內外前人研究的基礎上，探索了不同的冬孢子室內接種方法，并嚴格控制小麥生長各階段的環境條件，所采用4種接種方法，其中2種方法得到了TCK病穗，但發病率均較低。可能原因有：（1）病菌的侵入時期與小麥的感病時期不一致，導致病菌未能侵入小麥體內；（2）接種后，土壤等環境條件可能不利于冬孢子生長，導致病菌未能侵入小麥體內；（3）麥苗從低溫培養箱中移至高溫培養箱后溫度突然升高，麥苗生長迅速，大部分病菌未能侵入到小麥生長點。但本試驗仍然得到了部分發病植株，證明可在室內條件下完成TCK的整個侵染過程。在本試驗的基礎上，通過對試驗條件進一步優化，如使種子與病菌長時間充分接觸，有利于病菌的侵入；嚴格控制病菌侵入時期的低溫（約5～10℃）、高濕（約65%～75%）的環境條件；改善土壤理化條件，使其適合病菌生長及侵入小麥體內，將有可能得到較高的發病率。如果能在室內條件下得到穩定的TCK發病率，將能進一步通過TCK的鑒別寄主來確定不同病菌小種的致病性，以及目前我國現有主栽小麥品種對致病性高的病菌小種的抗病性，有助于有效評估TCK對我國小麥生產的風險，并從栽培抗病品種等方面入手加強對小麥矮腥黑穗病的控制。

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中圖分類號：S 435.121.4

文獻標識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.021

收稿日期：2013-05-05

修訂日期：2013-06-18

基金項目：國家“973”計劃項目（2009CB119200，2010CB951503，2011CB100403）；現代農業產業技術體系崗位科學家（CARS-03-04B）；農作物病蟲害疫情監測與防治

*通信作者E-mail：wqchen＠ippcaas.cn

Germination of teliospores and artificial inoculation of Tilletia controversa Kühn

Yao Zhuo， Chen Wanquan， Gao Li， Liu Taiguo， Liu Bo
（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests，Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

AbstractDwarf bunt of wheat，caused by Tilletia controversa Kühn is an international quarantine disease on wheat in China.Germination of teliospores and infection of T.controversa by different artificial inoculation methods were tested in the laboratory.The results indicated that the germination rate reached to its peak on the 45th－50th day in the soil extract agar medium.Concentration of teliospores had an impact on germination rate with the highest at the（100－105）×104／m L，which can be used for the inoculation concentration in the greenhouse.The wheat seeds were put on the wet filter paper in the cover of the soil extract agar medium with the germinated teliospores，the medium was overturned and incubated at 5℃until wheat seedlings grew to 3－5 cm，then the wheat seedlings were transplanted to the 24-cm-diameter plastic pots and kept in the growth chamber at 30℃during the day and 18℃during the night until the matured plants.The diseased plants reached to about 7%.

Key wordsTilletia controversa（TCK）； germination of teliospores； artificial inoculation test