E-cad、Snail表達與DukesB期大腸癌浸潤、轉移、預后的關系

許映 鄭伯安 鄧高里 董全進 趙仲生

E-cad、Snail表達與DukesB期大腸癌浸潤、轉移、預后的關系

許映 鄭伯安 鄧高里 董全進 趙仲生

目的 研究E-cad、Snail表達與大腸癌侵襲、轉移和預后的關系。方法采用免疫組化EnVision法，分別檢測E-cad、Snail在正常大腸黏膜上皮、大腸腺瘤及大腸癌患者癌組織中的表達。結果E-cad的表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、靜脈、淋巴管侵犯、淋巴結轉移與否及Dukes分期狀況密切相關（均P＜0．05），而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤病理類型無相關性（均P＞0．05）。45例Dukes B期的大腸癌患者中7例E-cad染色陰性，其1、3、5年生存率分別為85．71%、57．14%、0．00%；38例為中度陽性或強陽性，其1、3、5年生存率分別為97．37%、65．79%、39．47%，兩者比較有統計學差異（P＜0．01）。Snail表達與腫瘤病理類型、分化程度、浸潤深度、靜脈、淋巴管侵犯、淋巴結轉移與否及Dukes分期明顯相關（均P＜0．05），而與年齡、性別、腫瘤大小無相關性（均P＞0．05）。45例Dukes B期的大腸癌患者中26例Snail染色陰性，其1、3、5年生存率分別為100．00%、69．23%、42．31%；19例為中度陽性或強陽性，其1、3、5年生存率分別為89．47%、57．89%、26．32%，兩者比較有統計學差異（P＜0．01）。多因素分析結果顯示：腫瘤淋巴結轉移、Dukes分期、E-cad表達強度、Snail表達強度可預示患者術后生存情況（均P＜0．05）。E-cad與Snail在大腸癌組織中的表達呈顯著負相關（r=-0．508，P＜0．01）。結論E-cad與Snail可作為大腸癌患者的獨立預后指標，預示患者術后生存情況。Dukes B期大腸癌患者中，E-cad陰性者預后明顯較陽性者為差；Snail陽性者的預后明顯較陰性者為差。

Dukes B期大腸癌 E-cad Snail浸潤 轉移 預后

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發病率有逐 年上升的趨勢。盡管近年來以手術治療為主的綜合治療使大腸癌患者的預后有所改善，但術后5年生存率仍徘徊在50.00%～60.00%左右。惡性腫瘤的浸潤和轉移是患者術后死亡的主要原因[1]。因此，闡明大腸癌浸潤和轉移相關的分子機制及與患者預后的關系，從而指導臨床治療方案的選擇，可望達到減少術后復發和轉移、提高術后生存率的目的。

E-cad是與大腸癌浸潤和轉移較為密切的黏附分子，有抑制腫瘤浸潤轉移的功能。另有研究發現在許多腫瘤中，鋅指轉錄因子Snail的表達與E-cad表達的減少或缺失相關，而且充當E-cad轉錄的直接抑制因子。本研究檢測了正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌中，E-cad和Snail的表達與患者臨床病理特征的相關性，并初步探討兩者在Dukes B期大腸癌患者腫瘤浸潤轉移中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 收集1988—2001年浙江省人民醫院肛腸外科和富陽市人民醫院外科大腸癌手術患者的組織標本共142例，其中浙江省人民醫院102例，富陽市人民醫院40例。所有患者診斷均經手術和病理檢查證實。其中男80例，女62例；年齡15～78歲，中位年齡55歲；腫瘤直徑＜3cm者15例，3～5cm者101例，＞5cm者26例；病理類型：乳頭狀腺癌13例，管狀腺癌90例，黏液腺癌39例；分化程度：高分化者15例，中分化者96例，低分化者31例；Dukes分期：A期38例，B期45例，C期48例，D期11例。隨訪時間4～142個月，中位隨訪時間55.04個月。另選擇同時期正常大腸黏膜標本30例和大腸腺瘤標本30例為對照。標本均常規以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋。每例蠟塊行4μm連續切片，分別進行HE染色和免疫組化染色。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 即用型鼠抗人E-cad單克隆抗體為福州邁新生物技術開發中心產品，鼠抗人Snail（H-130）單克隆抗體購自美國Biotechnology公司，免疫組化En-Vision system試劑盒購自美國DAKO基因有限公司。

1.2.2 免疫組化染色 E-cad及Snail染色采用EnVision法，切片經微波抗原修復，以已知陽性片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 E-cad及Snail染色評分標準 E-cad陽性標準為細胞邊界細胞膜均勻染有棕黃色者為陽性，Snail陽性標準為細胞膜和細胞質內均勻染有棕黃色者為陽性。低倍鏡下觀察，選擇表達較集中的10個視野，換高倍鏡計數陽性細胞，按著色細胞百分比（I）分類為：＜10%，I= 0分；≥10%且≤90%，I=1分；＞90%，I=2分。根據染色強度（P）分類：陰性0分；弱陽性1分；中度陽性2分；強陽性3分。表達情況以（P+I）表示：陰性=0～1分，中度陽性=2～3分，強陽性=4～5分[2]。

1.3 統計學處理 應用SPSS 11.5統計軟件，計數資料間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，等級分組資料比較采用秩和檢驗。生存率比較采用Kaplan Meier檢驗；多因素生存率分析采用Cox回歸模型。相關性分析用Spearman等級相關分析。

2 結果

2.1 E-cad和Snail在正常大腸黏膜上皮、大腸腺瘤、大腸癌組織中的表達 30例正常大腸黏膜中E-cad染色均勻地分布在細胞邊界的細胞膜上，其中3例（10.00%）呈中度陽性，27例（90.00%）呈強陽性。30例大腸腺瘤中1例（3.33%）呈陰性，10例（33.33%）呈中度陽性，19例（63.33%）呈強陽性。而142例大腸癌患者中30例（21.13%）呈陰性，53例（37.32%）呈中度陽性，59例（41.55%）呈強陽性（圖1，見插頁）。3組間比較均有統計學差異（均P＜0.05）。

30例正常大腸黏膜中28例（93.33%）Snail染色呈陰性，只有2例（6.67%）為中度陽性，無強陽性表達。30例大腸腺瘤中22例（73.33%）呈陰性，8例（26.67%）呈中度陽性，也無強陽性表達。而142例大腸癌中68例（47.89%）為陰性，60例（42.25%）中度陽性，14例（9.98%）呈強陽性（圖2，見插頁）。3組間比較均有統計學差異（均P＜0.05）。

2.2 E-cad和Snail表達與大腸癌患者臨床病理特征的關系 E-cad陽性表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、靜脈侵犯、淋巴管侵犯、淋巴結轉移、Dukes分期均密切相關（均P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤病理類型無明顯相關性（均P＞0.05）。Snail表達與腫瘤病理類型、分化程度、靜脈侵犯、淋巴管侵犯、淋巴結轉移、Dukes分期均密切相關（均P＜0.05），而與年齡、性別、腫瘤大小均無明顯相關性（均P＞0.05），見表1。

2.3 大腸癌中E-cad和Snail表達的相互關系 142例患者的大腸癌組織中E-cad表達陰性、中度陽性和強陽性分別為30、53和59例。而Snail表達陰性、中度陽性和強陽性分別為68、60和14例。E-cad與Snail在大腸癌組織中的表達呈顯著負相關（r=-0.508，P＜0.01）。

2.4 E-cad和Snail表達與大腸癌預后的關系 142例患者中E-cad染色陰性者共30例，其1、3、5年生存率分別為86.67%、53.33%、33.33%；E-cad呈中度陽性者共53例，其1、3、5年生存率分別為92.45%、60.38%、45.28%；E-cad染色呈強陽性者共59例，其1、3、5年生存率分別為100.00%、76.27%、49.15%。提示E-cad呈陰性者預后最差，強陽性者預后最好，呈中度陽性者預后居中，3者間比較有統計學差異（P＜0.01）。

142例患者中Snail染色呈陰性表達者68例，其1、3、5年生存率分別為100.00%、70.59%、47.06%；中度陽性表達者共60例，其1、3、5年生存率分別為90.00%、63.33%、46.67%；強陽性表達者共14例，其1、3、5年生存率分別為85.71%、50.00%、21.43%。提示Snail陰性表達者預后最好，呈強陽性者預后差，呈中度陽性者居中，3者間比較有統計學差異（P＜0.01）。

2.5 大腸癌預后相關因子的多因素回歸分析 Cox多因素回歸分析提示，淋巴結轉移、Dukes分期、E-cad表達強度、Snail表達強度與大腸癌預后密切相關（均P＜0.05），可作為獨立的預后指標；而性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤病理類型、分化程度、浸潤深度、靜脈侵犯、淋巴結轉移等因素與大腸癌預后均無明顯相關性（均P＞0.05），見表2。

2.6 E-cad和snail的表達與Dukes B期大腸癌患者生存的關系 45例Dukes B期大腸癌患者中，7例E-cad染色為陰性，其 1、3、5年生存率分別為 85.71%、57.14%、0.00%；38例E-cad染色為中度陽性或強陽性，其1、3、5年生存率分別為97.37%、65.79%、39.47%，E-cad陰性者預后明顯較陽性者差（P＜0.01），兩者生存曲線見圖3。

45例患者中26例Snail染色為陰性，其1、3、5年生存率分別為100.00%、69.23%、42.31%；19例Snail染色為中度陽性或強陽性，其1、3、5年生存率分別為89.47%、57.89%、26.32%。Snail陽性者預后明顯較陰性者差（P＜0.01），兩者生存曲線見圖4。

3 討論

腫瘤的浸潤和轉移包括一系列步驟：腫瘤細胞脫離原發灶，侵犯周圍組織，進入循環系統，轉移至靶器官并增殖[3]。早在20世紀40年代，人們就發現惡性腫瘤細胞間的相互黏附作用明顯低于正常細胞。細胞間的黏附抑制可觸發癌細胞脫離原發灶，使癌細胞獲得浸潤特性。基于細胞的黏附功能在惡性腫瘤的組織發生、浸潤和轉移中起著極為重要的作用，近年來黏附分子在腫瘤浸潤和轉移中的作用及其分子生物學機制成為研究的熱點。黏附分子包括整合素類、CD44、鈣黏附蛋白類、免疫球蛋白超家族、凝集素類等，E-cad是與大腸癌浸潤和轉移較為密切的黏附分子。

E-cad是一簇跨膜糖蛋白，通過同種親合作用引起鈣依賴性細胞間黏附。細胞含有的E-cad分子越少，其黏附功能越差。既往研究揭示，人體惡性腫瘤細胞中的E-cad常呈不同程度的低表達，表達減低的腫瘤浸潤能力強，淋巴結轉移和遠處轉移率高，生存率相對較低。Lioni等[4]研究證實E-cad黏附能力的喪失是獲得去分化和有侵襲力表型的第一步，Chu等[5]和Herzig等[6]研究發現E-cad的確有抑制腫瘤浸潤轉移的功能。Peinado等[7]報道，當E-cad被特異性抗體阻斷后，無浸潤力的非轉化Madin Darby犬的腎上皮細胞（MDCK）重新獲得浸潤特性。由此提示E-cad表達喪失是惡性表型進展的關鍵步驟。E-cad與大腸癌關系的研究是近年來開展的新課題，各家的研究結果也并非一致。Zlobec等[8]應用免疫組化和原位雜交技術檢測了1 164例大腸癌標本，結果顯示E-cad蛋白的低表達不僅與大腸癌細胞的分化有關，還與淋巴結轉移和患者的預后呈正相關。Ngan等[9]應用免疫組化技術檢測了140例大腸癌組織中E-cad蛋白的表達情況，結果顯示E-cad蛋白在術后生存期＞5年的患者標本中的表達強度明顯高于生存期＜5年者，提示E-cad蛋白的表達水平是影響大腸癌患者預后的指標。

鋅指轉錄因子Snail屬于轉錄抑制因子中的Snail超家族，首次在果蠅中被描述，該基因突變的果蠅胚胎呈原腸胚缺陷的表現型，經證實與E-cad下調有關。研究發現在許多腫瘤中Snail的表達與E-cad表達的減少或缺失相關，而且充當E-cad轉錄的直接抑制因子。Snail主要以其鋅指區域與E-cad啟動子中的Epal元件（-178到+92bp）E盒結構主鏈上的CANNTG序列結合，從而發揮下調E-cad表達的作用[10]。在上皮細胞中Snail過度表達可導致向成纖維細胞的轉化，同時E-cad表達丟失伴隨腫瘤發生并獲得侵襲或轉移特性。

本研究結果顯示，從正常大腸黏膜到腺瘤再到大腸癌，E-cad的表達逐漸減弱；而Snail的表達則逐漸增強。E-cad、Snail表達與分化程度、浸潤深度、靜脈侵犯、淋巴管侵犯、淋巴結轉移、Dukes分期密切相關，表明兩者與大腸癌的浸潤和轉移密切相關。同時相關性分析結果顯示，Snail與E-cad呈負相關，這與文獻報道一致。E-cad呈中度陽性和強陽性的大腸癌患者，生存率明顯高于E-cad陰性者；而Snail呈中度陽性和強陽性的大腸癌患者，生存率明顯低于Snail陰性者。聯合檢測兩者在大腸癌中的表達可作為大腸癌預后的指標。近年來，Snail表達異常導致的E-cad表達的變化已在多種腫瘤中被證實，包括乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、惡性黑色素瘤及口腔鱗癌等。

在腫瘤進展中引起E-cad下調的分子機制的研究是近年的熱點，既往研究認為主要有以下3方面原因：（1）基因的缺失、失活及轉錄、翻譯異常；（2）轉錄啟動子高度甲基化；（3）E-cad因惡性腫瘤蛋白分解活性升高而降解[11]。近年來轉錄因子Snail的表達上調已見于報道，即E-cad功能紊亂發生在轉錄水平。Snail是E-cad轉錄的直接抑制因子，它與E-cad表達呈負相關，而與腫瘤的侵襲性及轉移性呈正相關[12]。Poser等[12]證實，在黑色素細胞中以RT-PCR不能檢測到Snail的表達，而在所有8種黑色素瘤細胞系中卻均呈明顯表達。同時Western blot和RT-PCR檢測提示在黑色素瘤細胞中E-cad表達顯著降低。由此可知，Snail表達的變化與E-cad的下調密切相關。異常表達Snail的上皮細胞顯示出成纖維細胞的表現型，并且獲得腫瘤發生和侵襲特性，因此Snail可作為惡性腫瘤的標志物，從而有助于開發特異性的抗腫瘤轉移藥物。

表2 大腸癌患者生存率的獨立預后因素

目前Dukes A期大腸癌因預后較好，故術后不需行輔助化療，而Dukes C期大腸癌預后較差，術后需輔助化療已成為共識，而Dukes B期的患者術后是否需要輔助化療尚有較多爭議。本研究顯示在Dukes B期的大腸癌患者中，E-cad陰性者較陽性者（包括中度陽性及強陽性）預后差；Snail陽性者（包括中度陽性及強陽性）較陰性者預后差，而在Dukes A期和Dukes C期中兩組患者生存率之間比較無差別。因此，在處理Dukes B期的患者時，按E-cad、Snail表達的不同，應采取不同的處理方法，即E-cad陰性或Snail陽性視為高危復發人群，應給予輔助化療；而對于E-cad陽性或Snail陰性的患者可視為低危患者，無需給予輔助化療，避免了患者的過度治療。

圖3 Dukes B期大腸癌患者E-cad表達與生存的關系

圖4 Dukes B期大腸癌患者Snail表達與生存的關系

[1]汪建平,楊祖立,王磊,等．結直腸癌臨床病理特征與預后的多因素回歸分析[J]．中華腫瘤雜志,2003,25(1)：59-61．

[2]張阿麗,王全勝,陳剛,等．Snail與E-cadherin在上皮性腫瘤中的表達及臨床意義[J]．腫瘤,2006,26(5)：469-471．

[3] Gouyer V,Fontaine D,Dumont P,et al．Autocrine induction of invasion and metastasis by tumor-associated trypsin inhibitor in human colon cancer cells[J]．Oncogene,2008,27(29)：4024-4033．

[4]Lioni M,Brafford P,Andl C,et al．Dysregulation of claudin-7 leads to loss of E-cadherin expression and the increased invasion of esophageal squamous cell carcinoma cells[J]．Am J Pathol,2007, 170(2)：709-721．

[5] Chu Q,Ling M T,Feng H,et al．A novel anticancer effect of garlic derivatives：inhibition of cancer cell invasion through restoration of E-cadherin expression[J]．Carcinogenesis,2006,27(11)：2180-2189．

[6]Herzig M,Savarese F,Novatchkova M,et al．Tumor progression induced by the loss of E-cadherin independent of β-catenin/ Tcf-mediated Wnt signaling[J]．Oncogene,2007,26(16)：2290-2298．

[7] Peinado H,Marin F,Cubillo E,et al．Snail and E47 repressors of E-cadherin induce distinct invasive and angiogenic properties in vivo[J]．J Cell Sci,2004,117(Pt 13)：2827-2839．

[8]Zlobec I,Lugli A,Baker K,et al．Role of ApAF-1,E-cadherin and peritumoral lymphocytic infiltration in tumour budding in colorectal cancer[J]．J Pathol,2007,212(3)：260-268．

[9]Ngan C Y,Yamamoto H,Seshimo I,et al．A multivariate analysis of adhesion molecules expression in assessment of colorectal cancer[J]．J Surg Oncol,2007,95(8)：652-662．

[10]Cheng C W,Wu P E,Yu J C,et al．Mechanisms of inactivation of E-cadherin in breast carcinoma：modification of the two-hit hypothesis of tumor suppressor gene[J]．Oncogene,2001,20(29)：3814-3823．

[11]熊艷,陳惠禎,劉少揚．上皮鈣黏附素在宮頸鱗癌中的表達及臨床意義[J]．腫瘤防治研究,2001,28(2)：112-114．

[12]Poser I,Domínguez D,de Herreros A G,et al．Loss of E-cadherin expression in melanoma cells involves up-regulation of the transcriptional repressor Snail[J]．J Biol Chem,2001,276(27)：24661-24666．

Expression of E-cad and Snail in Dukes B colorectal cancer and its relation to tumor invasion,metastasis and prognosis

Objective To investigate the expression of E-cad and Snail in Dukes B colorectal cancer and its relation to tumor invasion,metastasis and prognosis．MethodsThe expression of E-cad and Snail was detected by immunohistochemical EnVision method in 45 cases of Dukes B colorectal cancer．ResultsThe staining intensity of E-cad significantly was correlated with tumor differentiation,invasive depth,lymph node metastasis and Dukes stage,but not with age,gender,tumor size and pathological types．Among 45 cases of Dukes B colorectal cancer,E-cad was negatively expressed in 7 cases and positively expressed in 38,the 1-,3-and 5-year survival rate of negative E-cad and positive E-cad cancer were 85．71%,57．14%,0．00% and 97．37%,65．79%,39．47%,respectively(P＜0．01)．The staining intensity of Snail was significantly correlated with differentiation, pathological types,invasive depth,venous vessel invasion,lymphatic vessel invasion,lymph node metastasis and Dukes stage, but not with age,gender and tumor size．In 45 cases of Dukes B cancer,Snail was negatively expressed in 26 cases and positively expressed in 19 cases,the 1-,3-and 5-year survival rate of negative Snail expression and positive Snail expression cancer was 100．00%,69．23%,42．31%and 89．47%,57．89%,26．32%,respectively(P＜0．01)．The multivariate survival analysis demonstrated that lymph node metastasis,Dukes stage,expression of E-cad or Snail can predict survival of patients with colorectal cancer．ConclusionDukes B colorectal cancer with negative expression of E-cad or positive expression of Snail has poor prognosis．

Dukes B stage colorectal cancer E-cad Snail Invasion Metastasis Prognosis

2013-10-16）

（本文編輯：胥昀）

310014 杭州，浙江省人民醫院肛腸外科（許映、鄭伯安、鄧高里、董全進，許映系進修醫師，現在富陽市人民醫院肛腸外科工作），病理科（趙仲生）

鄭伯安，E-mail:13858180116@163.com