帕立骨化醇對糖尿病腎病大鼠腎保護機制的研究

高燕紅 羅群 蔡珂丹 鄔民香

帕立骨化醇對糖尿病腎病大鼠腎保護機制的研究

高燕紅 羅群 蔡珂丹 鄔民香

目的 探討帕立骨化醇對糖尿病腎病（DN）大鼠的腎保護作用及其可能機制。方法采用腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（STZ）構(gòu)建DN大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機分為帕立骨化醇組（P組）、DN組（D組），并設(shè)置健康對照組（N組）。P組大鼠每周腹腔注射帕立骨化醇3次，劑量為0．4μg/kg，給藥12周后檢測24h尿蛋白定量及血生化指標(biāo)，以實時PCR檢測腎組織腎素及環(huán)氧化酶-2（COX-2）mRNA表達，免疫組化檢測腎組織COX-2蛋白的表達，并以ELISA法檢測尿前列腺素E2（PGE2）水平。結(jié)果與N組相比，D組與P組24h尿蛋白定量、血肌酐（SCr）、空腹血糖及甲狀旁腺激素（PTH）均顯著升高（均P＜0．05），腎組織腎素和COX-2 mRNA及蛋白表達，以及尿PGE2水平均顯著升高（均P＜0．05），且D組顯著高于P組（P＜0．05）。腎素水平與尿PGE2水平及COX-2 mRNA表達均呈正相關(guān)（r=0．798、0．722，均P＜0．01）。結(jié)論帕立骨化醇可顯著減少DN大鼠早期蛋白尿，其機制可能與通過抑制腎組織COX-2表達，下調(diào)尿PGE2水平，從而抑制腎組織腎素表達有關(guān)。

糖尿病腎病 帕立骨化醇 腎素 前列腺素E2環(huán)氧化酶-2

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，是終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）的主要原因。腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在DN進展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，阻斷RAS已成為目前治療DN的重要措施。近年來研究發(fā)現(xiàn)維生素D類似物帕立骨化醇能夠起到抑制腎素分泌，減少尿蛋白及腎臟保護的作用，但其具體機制尚不清楚。本研究擬通過帕立骨化醇對DN大鼠蛋白尿、腎組織腎素、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）及尿前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）表達的影響，探討其腎保護機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 鏈脲佐菌素（STZ）購于美國Sigma公司，帕立骨化醇購于美國Abbott公司，尿總蛋白測定試劑盒為北京利德曼生化股份有限公司產(chǎn)品，PGE2ELISA試劑盒購于上海藍基生物科技有限公司，兔抗大鼠COX-2多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化試劑盒為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Trizol、RT-PCR試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購于大連寶生物工程有限公司，腎素、COX-2、β-actin引物合成于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 動物模型的建立和分組 雄性清潔級SD大鼠30只由浙江省動物實驗中心提供，約6～7周齡，體重（220.0±15.0）g，飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實驗動物中心。經(jīng)隨機數(shù)字表法分成3組，其中20只大鼠造模，余下10只作為健康對照組（N組）。大鼠禁食12h后，單次無菌腹腔注射STZ 65mg/kg。72h后尾靜脈采血，測空腹血糖（FBG），F(xiàn)BG≥16.7mmol/L確定為糖尿病大鼠。3周后留24h尿，測24h尿蛋白≥30mg，則確定DN大鼠造模成功。20只大鼠造模均成功，后再經(jīng)隨機數(shù)字表法分成帕立骨化醇組（P組）10只和DN組（D組）10只。P組大鼠將帕立骨化醇溶于0.05ml丙二醇中，以0.4μg/kg劑量每周腹腔注射3次；D組和N組大鼠均予等量丙二醇腹腔注射，3組均注射12周。12周后用代謝籠留取24h尿液，并殺死大鼠心臟取血4～6ml，分離雙側(cè)腎臟并稱重，部分腎組織以4%多聚甲醛固定，其余部分-80℃凍存。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 一般指標(biāo) 各組大鼠常規(guī)檢測24h尿蛋白定量、SCr、FBG、血鈣、血磷及甲狀旁腺激素（PTH）。

1.3.2 尿液PGE2測定 代謝籠留取大鼠24h尿液，其中取5.0ml，3 000r/min離心5min，取上清液，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｒ訣LISA法測定尿液PGE2水平。

1.3.3 腎組織病理和免疫組化 腎組織以4%多聚甲醛固定，石蠟切片常規(guī)HE染色觀察。免疫組化采用PV二步法。切片常規(guī)脫蠟、水化，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)。依次滴加COX-2一抗、二抗，DAB顯色，最后蘇木素復(fù)染、脫水、透明和封片，采用PBS替代一抗作陰性對照。每張切片400倍視野下隨機選取10個不重復(fù)腎小球掃描。使用Image pro plus 6.0對COX-2蛋白表達進行半定量分析，測定COX-2蛋白的平均吸光度值，并取其均值作為樣品的相對陽性表達量。

1.3.4 實時PCR 腎組織總RNA提取按照Trizol說明書進行。紫外分光光度計測定RNA濃度后，總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。腎素引物：上游：5′-AGAGGGTGCTAAAGGAGGAAGTGTT-3′，下游：5′-GTAGTGAAAGTTGCCCTGGTAATGT-3′，擴增片段119bp。COX-2引物：上游：5′-TCCTCCTGTGGCTGATGACTG-3′，下游：5′-CTGGGCAAAGAATGCGAACA-3′，擴增片段154bp。內(nèi)參β-actin引物：上游：5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游：5′-AAAGAAAGGGTGT AAAACGCA-3′，擴增片段432bp。采用Mx3005P QPCR儀進行PCR反應(yīng)：預(yù)變性95℃1min；變性95℃15s，退火57℃30s，延伸72℃30s，共40個循環(huán)；然后延伸95℃15s，57℃30s，95℃15s。記錄Ct值，結(jié)果處理按照2-ΔΔCT法：首先計算出每個標(biāo)本的目的基因及內(nèi)參β-actin的Ct值，ΔCT=Ct（目的基因）-Ct（β-actin），再按照ΔΔCT=ΔCT（P組/D組）-ΔCT（N組）進行組間比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。兩變量間相關(guān)性采用直線相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)比較 12周后，D組和P組24h尿蛋白定量、SCr、FBG、PTH和尿PGE2水平顯著高于N組，均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）；且D組24h尿蛋白定量、SCr、PTH和尿PGE2水平顯著高于P組，均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。但D組與P組間FBG無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；與P組比較，D組血鈣明顯下降，血磷明顯上升（均P＜0.05），P組血鈣、血磷與N組無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

2.2 12周后各組大鼠腎臟病理改變 HE染色結(jié)果顯示12周后N組大鼠無明顯病理學(xué)改變；D組大鼠腎小球腫脹，腎小球毛細血管基底膜增厚，彌漫性腎小球系膜區(qū)增寬、基質(zhì)增多；P組大鼠病理改變較D組有所減輕（圖1，見插頁）。

2.3 各組大鼠腎組織腎素、COX-2 mRNA及COX-2蛋白表達 12周后，腎素mRNA的表達在D組（1.48±0.14）和P組（1.23±0.10）均高于N組（1.03±0.12），且D組顯著高于P組，均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）；COX-2 mRNA的表達在D組（1.51±0.27）和P組（1.21±0.12）也高于N組（0.91±0.21），且D組顯著高于P組，均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05），見圖2。D組（0.69±0.31）和P組（0.44±0.67）的COX-2蛋白表達也高于N組（0.21±0.02），且D組顯著高于P組，均有統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05），圖3，見插頁。

圖2 各組大鼠腎組織腎素及COX-2 mRNA表達的熔解及擴增曲線

2.4 相關(guān)性分析 直線相關(guān)分析提示大鼠腎組織腎素水平與尿PGE2水平及COX-2 mRNA表達均呈正相關(guān)（r=0.798、0.722，均P＜0.01）。

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，維生素D類似物帕立骨化醇的生物學(xué)活性與活性維生素D非常相似，在有效控制高血鈣同時能夠降低PTH水平，抑制甲狀旁腺增生；并且可同時通過抑制RAS系統(tǒng)、細胞外基質(zhì)沉積、系膜細胞增殖和炎性因子分泌等途徑改善DN病理生理過程，從而保護腎臟[1-2]。近年的研究表明，其具有調(diào)控腎素分泌的作用[1，3]。蘭凱等[4]發(fā)現(xiàn)維生素D類似物帕立骨化醇可以抑制DN大鼠腎臟的腎素及血管緊張素Ⅱ的表達，減少DN大鼠蛋白尿，保護腎臟。Deb等[5]通過聯(lián)合運用氯沙坦及帕立骨化醇，證實帕立骨化醇能抑制代償性的腎素增加，減少蛋白尿，降低腎小球硬化，延緩腎功能衰竭進展，但帕立骨化醇抑制腎素分泌的機制目前尚不清楚。

近期在RAS研究中出現(xiàn)了一個新興領(lǐng)域，Vargas等[6]研究發(fā)現(xiàn)致密斑（macula densa，MD）細胞頂端膜上的G蛋白耦聯(lián)受體（G-protein-coupled，GPR91）能夠與三羧酸循環(huán)中的中間產(chǎn)物琥珀酸結(jié)合，激活p38和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2），隨后激活COX-2及PGE2的合成和釋放，引起球旁細胞（juxtaglomerular cell，JGC）腎素的釋放和腎素依賴性的RAS激活。琥珀酸與GPR91結(jié)合刺激MD細胞的COX-2、PGE2分泌增加從而促進腎臟局部RAS激活是DN早期的重要表現(xiàn)[7]。因此，筆者推測帕立骨化醇可通過MD細胞的COX-2-PGE2途徑抑制腎素合成，其可能是防治DN的重要突破口。

PGE2是MD細胞調(diào)控腎素分泌的關(guān)鍵遞質(zhì)。Schnermann等[8]研究發(fā)現(xiàn)氯化鈉在低濃度時可調(diào)節(jié)PGE2的釋放，從而調(diào)控腎素合成和釋放。Poschke等[9]通過低鹽飲食的方法，發(fā)現(xiàn)低鹽能夠刺激COX-2的表達，進而增加PGE2的合成，通過與PGE2受體4（E-prostanoid，EP4）結(jié)合，激活腎素的釋放。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，PGE2主要通過作用于其受體EP2和EP4，激活JGC上的Gsα耦聯(lián)受體，從而激活腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC），使細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）濃度增加，激活依賴cAMP的蛋白激酶A，促使腎素分泌[10]。許多研究已證實COX-2-PGE2能夠劑量依賴性的刺激腎素的合成和釋放[11-12]。PGE2在體內(nèi)代謝迅速，生物半衰期僅數(shù)分鐘，其大部分由尿液排出，故通過檢測尿液中的PGE2水平可有效反應(yīng)腎組織中PGE2的水平。

本研究發(fā)現(xiàn)，帕立骨化醇可以降低DN大鼠腎組織腎素水平，減少蛋白尿，與上述報道相一致[4-5]。本研究還提示帕立骨化醇可抑制腎組織COX-2蛋白及mRNA的表達，下調(diào)尿PGE2水平。腎組織腎素水平與COX-2 mRNA表達及尿液PGE2水平呈正相關(guān)。故筆者推測帕立骨化醇可能通過抑制COX-2-PGE2的表達，從而抑制腎素分泌，減少蛋白尿，起到保護腎臟的作用。帕立骨化醇如何調(diào)控COX-2-PGE2釋放以及帕立骨化醇是否還通過其他通路來調(diào)控腎素分泌，尚有待進一步的研究。

[1]Cunningham J,Zehnder D．New vitamin D analogs and changing therapeutic paradigms[J]．Kidney Int,2011,79(7)：702-707．

[2] 臧麗,劉芳,付平．1,25(OH)2D3與糖尿病腎病[J]．中華腎臟病雜志, 2011,27(7)：541-544．

[3]Dusso A S,Tokumoto M．Defective renal maintenance of the vitamin D endocrine system impairs vitamin D renoprotection：a downward spiral in kidney disease[J]．KidneyInt,2011,79(7)：715-729．

[4]蘭凱,羅群,周芳芳,等．帕立骨化醇對糖尿病腎病大鼠蛋白尿的影響[J]．中華腎臟病雜志,2012,28(7)：524-527．

[5]Deb D K,Sun T,Wong K E,et al．Combined vitamin D analog and AT1 receptor antagonist synergistically block the development of kidney disease in a model of type 2 diabetes[J]．Kidney Int,2010, 77(11)：1000-1009．

[6]Vargas S L,Toma I,Kang J J,et al．Activation of the succinate receptor GPR91 in macula densa cells causes renin release[J]．J Am Soc Nephrol,2009,20(5)：1002-1011．

[7]Peti-Peterdi J．High glucose and renin release：the role of succinate and GPR91[J]．Kidney Int,2010,78(12)：1214-1217．

[8]Schnermann J,Briggs J P．Tubular control of renin synthesis and secretion[J]．Pflugers Arch,2013,465(1)：39-51．

[9]Poschke A,Kern N,Maruyama T,et al．The PGE(2)-EP4 receptor is necessary for stimulation of the renin-angiotensin-aldosterone system in response to low dietary salt intake in vivo[J]．Am J Physiol Renal Physiol,2012,303(10)：F1435-F1442．

[10]Friis U G,Madsen K,Stubbe J,et al．Regulation of renin secretion by renal juxtaglomerular cells[J]．PflugersArch,2013,465(1)：25-37．

[11]Kim S M,Briggs J P,Schnermann J．Convergence of major physiological stimuli for renin release on the Gs-alpha/cyclic adenosine monophosphate signaling pathway[J]．Clin Exp Nephrol, 2012,16(1)：17-24．

[12] Chen L,Kim S M,Eisner C,et al．Stimulation of Renin Secretion by Angiotensin II Blockade is Gsα-Dependent[J]．J Am Soc Nephrol,2010,21(6)：986-992．

Renoprotective effect of paricalcitol in rats with diabetic nephropathy

Objective To investigate the renoprotective effect of paricalcitol in rats with diabetic nephropathy(DN)and its mechanism．MethodsDiabetic nephropathy was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin in rats．The DN rats were randomly divided into DN group(group D)and paricalcitol group(group P),rats in group P were intraperitonealy injected with 0．4μg/kg paricalcitol t．i．w．Healthy non-DN rats served as control group(group N)．After 12 weeks,24h urinary protein and serum biochemical indicators were examined．Real-time PCR were used to detect expression of renin mRNA and cyclooxygenase-2 (COX-2)in renal tissue．Immunohistochemistry was used to detect the protein expression of COX-2．ELISA method was used to detect the urine levels of prostaglandin E2(PGE2)．ResultsCompared to group N,24-h urinary protein,serum creatinine(SCr), fasting blood glucose(FBG)and parathyroid hormone(PTH)levels and urinary PGE2levels were significantly increased(P＜0．05) in groups D and P;the expression of renin mRNA,COX-2 mRNA and protein in renal tissue of groups D and P were also significantly increased(P＜0．05)．The above indexes of group D were markedly higher than those of group P (P＜0．05)．The renin level was positively correlated with urinary PGE2(r=0．798,P＜0．01)and COX-2 mRNA expression (r=0．722,P＜0．01)．ConclusionParicalcitol can significantly reduce the proteinuria in rats with diabetic nephropathy,which may be associated with down-regulation of COX-2,PGE2and renin expression．

Diabetic nephropathy Paricalcitol Renin Prostaglandin E2Cyclooxygenase-2

2013-09-23）

（本文編輯：胥昀）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技立項資助項目（2012KYB175）；寧波市自然科學(xué)基金資助項目（2011A61003）

315010 寧波市第二醫(yī)院腎內(nèi)科

羅群，E-mail:nbluoqun@163.com