磁流體熱療聯合IL-2對小鼠Lewis肺癌治療作用的實驗研究

胡潤磊 柯賢福 李滸 馬勝林 王國卿 魏東山

磁流體熱療聯合IL-2對小鼠Lewis肺癌治療作用的實驗研究

胡潤磊 柯賢福 李滸 馬勝林 王國卿 魏東山

目的 通過觀察磁流體熱療（MFH）聯合IL-2對小鼠Lewis肺癌的生長、凋亡及小鼠免疫系統的影響，探討MFH聯合免疫治療肺癌的可行性。方法建立小鼠淺表Lewis肺癌皮下移植瘤模型，瘤體直徑增至0．8cm左右時，將其分為IL-2組、MFH組、MFH+IL-2組及對照組。MFH組瘤體內部注射0．2ml水平約75mg/ml的磁流體，24h后在交變磁場下加溫1次，通過控制磁場的強度，加溫溫度穩定在43．0℃左右30min。IL-2組瘤體內部注射0．2ml（5×104U）的IL-2。MFH+IL-2組熱療后24h，按上述方法向腫瘤內部注射0．2ml（5×104U）的IL-2。對照組瘤體內部注射0．2ml的0．9%氯化鈉溶液。采用流式細胞術檢測MFH法、MFH+IL-2后小鼠外周血T淋巴細胞亞群的變化。采用免疫組化法檢測治療后腫瘤組織HSP70、CD4+、CD8+等免疫因子的表達，比較MFH組、MFH+IL-2組對腫瘤的治療效果。結果MFH組和MFH+IL-2組注射磁流體后腫瘤內部溫度迅速升高至43℃，腫瘤細胞呈凋亡和壞死樣改變，小鼠外周血T淋巴細胞水平明顯升高（P＜0．05），HSP70、CD4+、CD8+水平也均明顯升高，小鼠瘤體生長均受到抑制，MFH+IL-2組小鼠瘤體生長抑制更明顯。結論43℃、30min條件下的MFH能抑制Lewis肺癌的生長，誘導荷瘤小鼠機體產生抗腫瘤免疫。IL-2單獨對荷瘤小鼠腫瘤生長無明顯抑制作用，但可以提高外周血CD4+、CD8+水平，從而增強MFH對Lewis肺癌抑瘤效果。

磁流體 熱療 肺癌 免疫

磁流體熱療（magnetic fluid hyperthermia，MFH）是近年腫瘤治療的研究熱點，系將磁流體通過直接注射或動靜脈注射的方式到達腫瘤區域，外加交變磁場，使電場的能量集中到磁流體聚集的特定部位并升溫至一定程度，從而殺死腫瘤細胞。由于周圍正常組織沒有或很少有磁流體的分布，不升溫或升溫不明顯，因此MFH治療具有高度的靶向性和特異性[1]。研究表明，熱療可誘導機體產生抗腫瘤免疫[2]，熱療尤其是MFH聯合免疫治療惡性腫瘤是一個較新的研究領域。本研究采用MFH聯合IL-2對肺癌進行實驗研究，觀察MFH聯合免疫治療對小鼠Lewis肺癌生長、凋亡以及小鼠免疫系統的影響，探討MFH聯合這一方法肺癌的可行性，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 胰蛋白酶、細胞培養基粉（RPMI 1640）及抗小鼠HSP70、CD4+、CD8+免疫組化單克隆抗體由杭州昊天生物有限公司提供。抗小鼠CD4+、CD8+流式細胞單克隆抗體由美國BD公司提供。重組人IL-2（國藥準字S20040008）由北京四環制藥有限公司提供。

1.1.2 細胞株 Lewis肺癌細胞株由杭州昊天生物有限公司提供，采用含10%胎牛血清RPMI 1640培養液進行培養。

1.1.3 磁流體 納米級Fe3O4顆粒采用化學共沉淀法制成膠體混懸液,呈黑色，樣品粒徑范圍為10～40nm，磁飽和強度360GS。Fe3O4顆粒樣品使用前均以超聲波處理5min,使其分布更均勻。

1.1.4 主要儀器設備 SP-04AC型4kW高頻感應加熱機由深圳市雙平電源技術有限公司提供，頻率為100～250kHz，感應線圈由4匝直徑為4mm的銅管平行繞成內徑為3cm，長為4cm的線圈，銅管內通循環水。YF-200型光纖溫度傳感器由西安永泰傳感有限公司提供，FACSCalibur型流式細胞儀由美國BD公司提供。

1.1.5 實驗動物 6～8周齡C57BL/6小鼠[實驗動物生產許可證SCXK（浙）2008-0035，使用許可證SYXK（浙）2008-0113]60只，均為雌性，質量20～24g,由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供并飼養,中心實驗動物屏障系統，空氣潔凈度萬級，換氣次數15次/h，溫度21～24℃，濕度75%～80%。

1.2 實驗方法

1.2.1 Lewis肺癌細胞的復蘇傳代 將液氮凍存的Lewis肺癌細胞懸液取出，置于37.0℃水浴中充分融化冰塊，低速離心，棄去上清液，采用1640培養液稀釋后接種于小鼠右脅部皮下，接種3只。

1.2.2 腫瘤模型的建立 待復蘇傳代的腫瘤增至直徑約2.0cm時，處死小鼠，剝離健康瘤組織，選取生長良好的腫塊，按腫瘤（g）：0.9%氯化鈉注射液（ml）=1：3比例勻漿，調細胞數約為1.0×107/ml，于每只小鼠右側脅部皮下接種此懸液0.2ml。接種后第4天開始觀察腫瘤生長情況，隔天用游標卡尺測量上述瘤體的大小，并以下列公式計算腫瘤體積：V=1/2ab2（a為腫瘤的長徑，b為垂直于長徑的短徑）。

1.2.3 實驗分組 接種后第4天左右即有瘤體長出，待瘤體長至直徑約（0.8±0.1）cm，采用隨機數字表法分為4組，每組15只。MFH組瘤體內部一次進針、多點注射0.2ml水平約75mg/ml的磁流體，24h后在交變磁場下加溫1次，通過控制磁場的強度，加溫溫度穩定在43.0℃左右30min。免疫治療組（IL-2組）瘤體內部一次進針、多點注射0.2ml（5×104U）的IL-2。免疫聯合MFH組（MFH+IL-2組）熱療后24h，按上述方法向腫瘤內部注射0.2ml（5×104U）的IL-2。對照組瘤體內部一次進針、多點注射0.2ml的0.9%氯化鈉注射液。

1.2.4 觀察指標 （1）小鼠的一般情況。（2）治療后腫瘤體積的變化。（3）根據瘤體的體積計算各組的腫瘤體積抑制率。腫瘤體積抑制率=（1-實驗組瘤體體積/對照組瘤體體積）×100%。（4）治療后腫瘤質量變化。（5）治療后2周處死所有小鼠，剝除瘤體，稱重，根據瘤體的質量計算各組的腫瘤質量抑制率，腫瘤質量抑制率=（1-實驗組瘤體質量/對照組瘤體質量）×100%。

1.2.5 光鏡觀察熱療后腫瘤病理組織學變化 加溫后48h，各組隨機挑選3只小鼠，脫頸處死，取出瘤體，甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察腫瘤細胞的變化。

1.2.6 流式細胞術檢測荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+的變化 熱療后1周，每組隨機挑選4只小鼠，眼球取血0.5ml，20U/L肝素抗凝，離心，棄上清，沉淀物加磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，用淋巴細胞分離液分離制備淋巴細胞，調整細胞水平至1×106/ml，免疫熒光進行染色（按照試劑盒方法進行），染色后采用流式細胞儀及CellQuest軟件分析各組T淋巴細胞亞群陽性細胞的百分率。

1.2.7 免疫組化檢測腫瘤組織中HSP70、CD4+、CD8+表達 繼續將上述甲醛固定腫瘤組織中HSP70、CD4+、CD8+進行免疫組化檢測。采用PBS代替一抗作為陰性對照，具體步驟按試劑盒方法進行操作。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件，計量資料采用表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 小鼠接種腫瘤后的一般情況 移植瘤成瘤率100%，成瘤時間為細胞種植后第4～7天，集中在第8～10天。細胞種植后第14天，腫瘤直徑平均可達0.8cm。成瘤后早期小鼠的質量和活動情況沒有明顯改變，但隨著腫瘤形成并逐漸增大，小鼠逐漸消瘦，活動減少。

2.2 磁流體在腫瘤內部升溫情況 注射磁流體后，瘤體內部的溫度迅速升高至43.0℃，通過控制磁場強度將溫度穩定在43.0℃左右，并維持30min，而小鼠肛門的溫度穩定在32.0℃左右。

2.3 病理組織學變化

2.3.1 大體觀察 治療后，IL-2組、對照組腫瘤進行性增長；MFH組大部分瘤體表面結痂，2～3d出現局部壞死，壞死脫落后表面凹凸不平，腫瘤生長明顯減慢；MFH+IL-2組瘤體生長較MFH組更為緩慢。

2.3.2 光鏡觀察 IL-2組和對照組的瘤體生長旺盛，細胞核濃染，偶而可見核分裂像，腫瘤中心部位可見少量壞死的組織。MFH組、MFH+IL-2組的瘤體在加溫后出現大量呈凋亡形態的腫瘤細胞，表現為核固縮，染色質邊聚、濃縮；部分區域出現凝固性壞死的征象，表現為嗜酸性增強，正常細胞結構消失，核碎裂、溶解；在凋亡和壞死的一些區域偶可見出血灶，可見磁流體分布于凋亡和壞死的區域中。散在的磁流體在一定范圍內分布于腫瘤細胞之間（圖1）。

圖1 光鏡下各組瘤體病理學變化（A：MFH組；B：IL-2組；C：MFH+IL-2組；HE染色，×100；D：對照組）

2.4 熱療后外周血T淋巴細胞變化 治療后各組小鼠T淋巴細胞亞群的變化見表1。

表1 治療后各組小鼠T淋巴細胞亞群的變化（）

表1 治療后各組小鼠T淋巴細胞亞群的變化（）

注：與對照組比較，*P＜0.05

組別MFH組IL-2組MFH+IL-2組對照組CD4+（%）29.98±0.32*29.37±0.75*36.93±1.09*26.90±0.83 CD8+（%）14.89±0.59 15.09±0.12*16.34±0.47*14.71±0.17 CD4+/CD8+2.02±0.07*1.94±0.04*2.26±0.10*1.83±0.04

2.5 熱療后腫瘤組織中HSP70以及CD4+、CD8+表達情況 免疫組化提示HSP70在MFH組和MFH+IL-2組中明顯表達，在IL-2組和對照組表達不明顯（圖2）。CD4+和CD8+在對照組和IL-2組中極少表達，而在MFH組和MFH+IL-2組表達明顯增高（圖3、4）。

2.6 治療效果 治療后，IL-2組和對照組腫瘤生長受到抑制不明顯，而在MFH組和MFH+IL-2組，小鼠的瘤體生長速度變慢（圖5）。治療后2周，MFH組、IL-2組、MFH+IL-2組及對照組小鼠瘤體體積及小鼠瘤體質量比較見表2。

圖2 免疫組化檢測HSP70在各組的表達（A：IL-2組和對照組表達不明顯，B：MFH組和MFH+IL-2組明顯表達，HE染色，×200）

圖3 免疫組化檢測腫瘤組織中CD4+的表達（A：IL-2組和對照組表達不明顯，B：在MFH組和MFH+IL-2組中明顯表達，HE染色，×200）

圖4 免疫組化檢測腫瘤組織中CD8+的表達（A：IL-2和對照組中，CD4+表達不明顯，B：在熱療組和MFH+IL-2組中明顯表達，HE染色，×200）

圖5 熱療后各組小鼠瘤體生長趨勢圖

3 討論

肺癌是嚴重危害人們生命健康的常見疾病，手術治療、化療以及放療可使部分患者受益。但大部分病例發現均屬晚期，手術效果差；放化療由于毒副作用大，多數患者不能耐受。傳統的熱療作用的方法，如射頻、微波、超聲等都有加溫的特異性差，不能針對某一特定靶區加溫，明顯降低熱療效果。因此探索一種治療效果好且不良反應小的熱療方法成為了研究課題。我們將MFH對小鼠Lewis肺癌移植瘤進行治療實驗，結果證實磁流體在腫瘤內部可以升溫至有效的治療溫度，通過調節磁場電流將溫度控制在43℃左右，而小鼠肛門溫度卻穩定在32℃左右，說明周圍正常組織沒有明顯的升溫，初步實現了MFH的靶向性。

表2 熱療后2周各組小鼠瘤體體積和質量比較

近些年來的基礎研究表明，腫瘤熱療后會產生HSP，其中HSP70與免疫的關系越來越引起關注。研究證實，HSP70可提高機體內的多種趨化因子水平，提高腫瘤細胞表面主要組織相容性復合體類抗原的表達，促進樹突狀細胞的成熟[2-3]，從而誘導機體產生抗腫瘤免疫[4]。

研究表明，腫瘤的免疫方面主要是細胞免疫發揮更重要的作用[5]，T細胞介導的腫瘤細胞免疫有兩種形式，即通過CD4+和CD8+來實現的。CD4+T淋巴細胞主要是產生IL-2、IFN-γ、TNF-a等細胞因子誘導CD8+T淋巴細胞，還可以通過誘導、活化抗原遞呈細胞（APC），增加APC的抗原遞呈能力及其共刺激信號的表達，更高效地激活CD8+T淋巴細胞。我們的結果研究發現，43℃的MFH可以使小鼠的皮下移植瘤HSP70的表達明顯增加，CD4+、CD8+的表達也明顯增加；通過對荷瘤小鼠外周血的T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+的檢測，表明MFH明顯提高外周血CD4+、CD8+的水平，CD4+/CD8+比值明顯升高，說明MFH能提高腫瘤局部HSP70表達，誘導荷瘤小鼠機體產生抗腫瘤免疫。

IL-2是活化的T細胞產生的淋巴細胞因子，同時也是人體重要的免疫調節因子，可以通過與其他免疫因子相互協同，誘導T淋巴細胞的增殖，增加細胞毒T淋巴細胞的活性，誘導輔助性T淋巴細胞及NK細胞的活性。在惡性黑色素瘤和腎癌的研究中發現，IL-2可以激活淋巴因子，增加淋巴細胞的活性，從而產生抗腫瘤作用[6-7]。我們的研究結果顯示，IL-2組荷瘤小鼠外周血CD4+、CD8+明顯升高，但在腫瘤組織中CD4+、CD8+無明顯表達，該組的腫瘤生長未受到明顯的抑制。說明IL-2單獨應用的對肺癌的抗腫瘤效果較差，可能與IL-2在免疫調節中與T淋巴細胞自主調節有關[8]，具體的機制有待于進一步研究。

通過對各組荷瘤小鼠的抗腫瘤效果的分析，IL-2組小鼠瘤體生長抑制不明顯，MFH組和MFH+IL-2組瘤體生長受到抑制，其中MFH+IL-2組的抑瘤效果最明顯，說明IL-2能增強MFH對Lewis肺癌抑瘤效果。

本研究表明，43℃、30min條件下的MFH能明顯抑制Lewis肺癌的生長，提高荷瘤小鼠外周血和腫瘤組織CD4+、CD8+的水平，誘導荷瘤小鼠機體產生抗腫瘤免疫反應。LI-2單獨對荷瘤小鼠腫瘤生長無明顯抑制，可以提高外周血CD4+、CD8+水平。IL-2能增強MFH對Lewis肺癌抑瘤效果。

[1] Li X H,Rong P F,Jin H K,et al．Magnetic fluid hyperthermia induced by radiofrequency capacitive field for the treatment of transplanted subcutaneous tumors in rats[J]．Exp Ther Med, 2012,3(2)：279-284．

[2]Chen T,Guo J,Han C,et al．Heat shock protein 70,released from heat-stressed tumor cells,initiates antitumor immunity by inducing tumor cell chemokine production and activating dendritic cells via TLR4 pathway[J]．J Immunol,2009,182(3)：1449-1459．

[3]Torigoe T,Tamura Y,Sato N．Heat shock proteins and immunity：application of hyperthermia for immunomodulation[J]．Int J Hyperthermia,2009,25(8)：610-616．

[4]Kobayashi T．Cancer hyperthermia using magnetic nanoparticles [J]．Biotechnol J,2011,6(11)：1342-1347．

[5]Koido S,Homma S,Hara E,et al．Regulation of tumor immunity by tumor/dendritic cell fusions[J]．Clin Dev Immunol,2010;2010：516768．

[6]Quan W D Jr,Quan F M．High-dose intensity pulse interleukin-2 with famotidine in metastatic kidney cancer[J]．Cancer Biother Radiopharm,2009,24(2)：181-183．

[7] Quan W D Jr,Walker P R,Picton M,et al．High-dose intensity pulse interleukin-2 with famotidine has activity in metastatic melanoma[J]．Cancer Biother Radiopharm,2008,23(5)：641-646．

[8]Waldmann T A,Cooper M A,Caligiuri M A．Inerleukin-2 an Inerleukin-15：implications for cancer therapy and vaccine design[J]．Nat Rev Immunol,2006,6(8)：595-601．

Combination of magnetic fluid hyperthermia with inerleukin-2 for treatment of Lewis lung carcinoma in mice

ObjectiveTo investigated the combination of magnetic fluid hyperthermia (MFH)with immunotherapy for treatment of Lewis lung carcinoma in mice．MethodsThe mouse Lewis lung cancer model was induced by subcutaneous infection of tumor cells,the tumor-bearing mice were divided into 4 groups：control group,IL-2 group,MFH group and MFH+IL-2 group when the tumor diameter reached 0．8cm．Magnetic fluids were prepared in vitro and directly injected into tumors．Twenty-four hours later,the mice were subjected to an alternating magnetic field．The temperature in the tumor was increased to 43．0℃,which was maintained for 30 min with a stable strength of magnetic field．At 24h after MFH,IL-2 was injected directly into the tumor in MFH+IL-2 group．Peripheral CD4+and CD8+T-lymphocytes were analyzed by flow cytometry,CD4+,CD8+and HSP70 in tumors were detected by immunohistochemistry staining．ResultsCombined magnetic fluid hyperthermia and immunotherapy significantly inhibited the growth of the tumors(P＜0．05)．Histological analysis demonstrated that the tumor cells underwent apoptosis and necrosis,HSP 70,CD4+and CD8+cells were significant increased after treatment(P＜0．05)．ConclusionCombined magnetic fluid hyperthermia and immunotherapy can improve the therapeutic efficacy for Lewis lung cancer in mice．

Magnetic fluid Hyperthermia Lung cancer Immunotherapy

2013-06-24）

（本文編輯：楊麗）

浙江省醫藥衛生科學研究基金（2009A163）；杭州市科技發展計劃項目（20080333B02）；杭州市醫藥衛生重點計劃（2012Z002）

310006 杭州市第一人民醫院胸外科（胡潤磊、李滸、王國卿、魏東山），放療科（馬勝林）；浙江省醫學科學院實驗動物中心（柯賢福）

胡潤磊，E-mail:hurunlei@163.com