MiRNA-24在良、惡性胸水鑒別診斷中的應用價值研究

張斌杰 樂涵波 張永奎 劉曉光 周吉航 竺王玉 陳志軍

MiRNA-24在良、惡性胸水鑒別診斷中的應用價值研究

張斌杰 樂涵波 張永奎 劉曉光 周吉航 竺王玉 陳志軍

目的 研究良性與惡性胸水中miRNA表達的差異，為臨床早期鑒別良、惡性胸水提供依據。方法抽取18例肺癌患者及10例肺部良性病變患者的胸水，運用莖環逆轉錄熒光定量PCR法檢測let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表達水平，分析其在良、惡性胸水中的表達差異。結果miRNA-24在惡性胸水中的表達高于在良性胸水中的表達，差異有統計學意義（P=0．032），而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在良、惡性胸水中的表達差異無統計學意義（P=0．076、0．320、0．076、0．372）。結論miRNA-24在惡性胸水中高表達，檢測胸水中miRNA-24的表達水平可能是新的鑒別胸水良、惡性的手段。

胸腔積液 microRNA 診斷

肺癌是一種嚴重威脅人類健康和生命的疾病，在我國其病死率仍呈明顯上升趨勢，其病死人數已位居國內各類腫瘤死亡人數首位[1]。胸腔積液（胸水）是肺癌等多種胸部疾病常伴發的一個重要臨床表現。鑒別胸水的良、惡性對患者的治療及預后具有重要意義。特別是對于僅有胸腔積液，但影像學及細胞學檢測均為陰性的患者，胸水良、惡性的鑒別具有重要的診斷意義。miRNA是一類存在于真核細胞中的內源性非編碼單鏈小RNA，通過與目標mRNA的3′非編碼區互補配對，抑制miRNA的翻譯，導致基因沉默。近年多項研究表明，miRNA與多種人類惡性腫瘤細胞的發生、侵襲轉移及凋亡有著密切的聯系[2-3]。

本研究檢測肺癌及肺部良性病變患者的let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表達差異，并與胸水癌胚抗原（CEA）、糖類抗原19-9（CA19-9）進行比較，分析miRNA表達水平在良、惡性胸水鑒別診斷中的臨床應用價值，現報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2011-01—2012-12我院抽取胸水的患者共28例。其中肺癌患者（除肺癌外無其他主要疾病，惡性胸水組）18例，男10例，女8例，年齡43～89（62.5±11.9）歲；肺部良性病變患者（良性胸水組）10例，男5例，女5例，年齡39～91（64.1±13.9）歲。所有胸水標本均在抽取后半小時內放入-80℃冰箱中凍存。

1.2 方法

1.2.1 抽提胸水miRNA 使用美國ABI公司試劑盒抽提胸水中的miRNA，操作嚴格按照說明書進行。抽提的miRNA濃度采用ABI公司的TaqMan探針利用熒光定量PCR儀進行檢測并分析。

1.2.2 莖環逆轉錄熒光定量PCR法檢測胸水中miRNAs表達 以U6為內參，let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a與U6同批擴增，每個樣本做3個復孔，取平均值。應用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒（美國ABI公司）將miRNA轉錄為cDNA，反應體系為10×RT緩沖液 0.75μl，RNA酶抑制劑0.095μl，dNTP0.075μl，逆轉錄酶0.5μl，引物1.5μl，模板1.5μl，用DEPC水稀釋到7.5μl，反應條件為16℃30min，42℃30min，85℃5min；應用7500實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）檢測miRNA表達，試劑為TaqMan通用混合液Ⅱ，反應體系為10μl TaqMan無尿素酶2×通用PCR混合液,1μl基因特異引物，1μl模板，DEPC水稀釋至20μl，反應條件為95℃10min，95℃15s 40個循環，60℃1min。循環數（Ct）值由SDS 2.0.1 Software（美國ABI公司）計算，以U6為內參，計算miRNA的2-ΔCt值。無核苷酸水代替模板的反應體系為陰性對照，肺癌細胞株A549作為陽性對照。

1.2.3 胸水CEA、CA19-9檢測 采用化學發光法檢測胸水中CEA、CA19-9水平，使用Beckman Coulter公司UnicelDXI800化學發光儀及原配套試劑。CEA＞5.0ng/ ml，CA19-9＞37.0IU/ml判定為陽性。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件，計量資料以表示，比較采用兩獨立樣本t檢驗。相關性分析采用Pearson相關性檢驗。

2 結果

2.1 良、惡性胸水中miRNAs表達 見表1。

表1 良、惡性胸水中miRNA表達（2-ΔCt）

由表1可見，miRNA-24在惡性胸水中的表達明顯高于在良性胸水中的表達，差異有統計學意義（P=0.032），而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在惡性胸水中的表達雖然高于在良性胸水中的表達，但差異無統計學意義（P=0.076，0.320，0.076，0.372）。

2.2 良、惡性胸水CEA、CA19-9表達 良、惡性胸水的腫瘤標志物的含量的檢測結果顯示，CEA與CA19-9在惡性胸水中的水平[（1160±515.4）、（237.6±96.2）ml]均明顯高于良性[（237.6±96.2）、（10.16±6.461）ml]，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。在良、惡性胸水中，mirRNA-24與CEA和CA199的表達均無明顯相關性（r=-0.086，P＞0.05）。

3 討論

目前國內對miRNA的研究主要集中于血清及腫瘤細胞上，對胸水中miRNA的研究相對較少，胸水的抽取或者引流本身即為胸腔積液患者治療的一種基本方法，其操作創傷性相對較小，獲得的標本量較大，是一種比較理想的檢測標本。所以，通過檢測胸水中miRNA的種類與含量來鑒別胸水的良、惡性有重要的意義與較好的實用性。

我們運用逆轉錄熒光定量PCR技術檢測良、惡性胸水中let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表達,發現miRNA-24在惡性胸水中的表達高于在良性胸水中的表達，并且差異有統計學意義，而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在良、惡性胸水中的表達雖然也有差異，但差異無統計學意義。Xie等[4]應用一種外源性的植物miRNA-athmiRNA-156a作為內參，對110例胸水（包括28例良性，82例惡性）中miRNA-24及miRNA-30d的表達水平進行了檢測，結果發現miRNA-24和miRNA-30d在惡性胸水中的表達要明顯高于在良性胸水中的表達，其差異均有統計學意義。本研究結果與Xie等的研究結果不完全相同，出現這種差異可能與兩個研究的研究樣本量均偏小以及兩個研究所選用的內參基因不同有關。

miRNA-24在細胞中主要起到調節細胞生長與凋亡的功能。在不同腫瘤的生長、發展及凋亡過程中，其既可能作為原癌基因存在，又可能作為抑癌基因發揮作用。Xie等[5]通過研究肺癌細胞、宮頸癌細胞、食管癌細胞、乳腺癌細胞發現：miRNA-24可以通過降低X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）的表達，從而降低腫瘤細胞凋亡的閾值，促進腫瘤細胞的凋亡。而Cameron等[6]通過研究受到EB病毒感染的B淋巴細胞發現，在這些受感染的B淋巴細胞中miRNA-24的表達水平明顯升高，提示miRNA-24可能在EB病毒介導的淋巴瘤的發生過程中起促進作用。

本研究同時發現，惡性胸水中CEA及CA19-9的表達水平亦高于良性胸水，其差異有統計學意義。該結果提示CEA及CA19-9可作為良、惡性胸水的一項鑒別指標。我們進一步分析了胸水中miRNA-24與CEA、CA19-9的相關性，結果分析表明胸水中miRNA-24與CEA及CA19-9之間無相關性。上述結果提示胸水miRNA-24、CEA及CA19-9均可以用于鑒別良、惡性胸水，其中miRNA-24可作為一項獨立的預測因素，與胸水CEA、CA19-9無關，對于胸水CEA、CA19-9陰性的惡性胸水患者有一定的鑒別意義。

綜上所述，miRNA-24在良、惡性胸水中的表達存在明顯差異，其可作為良、惡性胸水鑒別的一項有效指標。與胸水中傳統的腫瘤標志物CEA及CA19-9相比，miRNA-24是一項獨立的惡性胸水的預測指標，對胸水CEA、CA19-9陰性的患者有一定的預測意義。胸水miRNA-24的表達情況的檢測可以作為一種新的鑒別良、惡性胸水的方法，值得推廣應用。

[1]Guo P,Huang Z L,Yu P,et al．Trends in cancer mortality in China：an update[J]．Annals of Oncology,2012,23(10)：2755-2762．

[2]Brennecke J,Hipfner D R,Stark A,et al．Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the pro-apoptotic gene hid in Drosophila[J]．Cell, 2003,113(1)：25-36．

[3]Gupta G P,Massagué J．Cancer metastasis：building a framework[J]．Cell,2006,127(4)：679-695．

[4]Xie L,Wang T,Yu S,et al．Cell-free miR-24 and miR-30d,potential diagnostic biomarkers in malignant effusions[J]．Clinical Biochemistry．2011,44(2-3)：216-220．

[5]Xie Y,Tobin L A,Camps J,et al．MicroRNA-24 regulates XIAP to reduce the apoptosis threshold in cancer cells[J]．Oncogene,2013, 32(19)：2442-2451．

[6]Cameron J E,Fewell C,Yin Q,et al．Epstein-Barr virus growth/latency III program alters cellular microRNA expression[J]．Virology, 2008,382(2)：257-266．

MicroRNA-24 is expressed at high level in malignant pleural effusion

Objective To investigate the expression levels of microRNAs in malignant and benign pleural effusion．MethodsPleural effusion samples were collected from 18 cases of lung cancer and 10 cased of benign diseases．The expression levels of let-7b,miRNA-24,miRNA-27b,miRNA-30d and miRNA-128a in the pleural effusion were detected with stem loop primer FQ RT-PCR method．ResultsThe expression of miRNA-24 in malignant pleural effusion was higher than that in benign pleural effusion(P=0．032);however there were no significant difference in expression of Let-7b,miRNA-27b,miRNA-30d and miRNA-128a between malignant and benign pleural effusion(P=0．076,0．320,0．076 and 0．372,respectively)．ConclusionmiRNA-24 is expressed at higher level in malignant pleural effusion,indicating that miRNA-24 may be used to differentiate malignant pleural effusion from benign one．

Pleural effusion MicroRNA Diagnosis

2013-05-24）

（本文編輯：楊麗）

浙江省衛生廳基金資助項目（2011KYB165）；舟山市科技局重大項目（2011C12039）

316000 舟山醫院胸心外科

樂涵波，E-mail:zslehanbo@163.com