星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化加味圣愈湯的提取工藝

楊秀梅, 歐小群, 譚茂蘭, 湯朝暉, 李煒弘, 黃勤挽（成都中醫(yī)藥大學, 四川 成都611137）

星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化加味圣愈湯的提取工藝

楊秀梅, 歐小群, 譚茂蘭, 湯朝暉, 李煒弘, 黃勤挽*（成都中醫(yī)藥大學, 四川 成都611137）

目的 利用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化加味圣愈湯 （人參、 黃芪、 白芷、 三棱等組成） 的提取工藝。 方法 以乙醇體積分數(shù)、 溶劑倍數(shù)、 提取時間為自變量， 以人參皂苷 Rg1、 Re、 Rb1、 歐前胡素、 異歐前胡素的總評歸一值為評價指標， 擬合二次項方程， 繪制三維效應(yīng)面圖， 選取最佳提取工藝。 結(jié)果 最佳提取工藝為:72%乙醇， 溶劑倍數(shù)為10 倍， 提取 2 次， 每次 2.5 h。 結(jié)論 星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化加味圣愈湯的提取工藝方法簡便， 預測性好。

加味圣愈湯;提取工藝;星點設(shè)計;效應(yīng)面

加味圣愈湯主要由人參、黃芪、白芷、三棱等藥味組成，來源于成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院臨床經(jīng)驗方，用于治療黃褐斑，用藥歷史悠久，臨床療效好。

該方原來臨床應(yīng)用為煎煮成濃湯后浸泡紗布敷臉使用，但患者使用不方便，現(xiàn)擬進行劑型改革制備成水凝膠劑，本實驗研究其提取工藝，為后續(xù)成型工藝和質(zhì)量標準奠定基礎(chǔ)。 星點設(shè)計-效應(yīng)面法由于其精密度較高、預測性較好，近年來在工藝篩選方面應(yīng)用廣泛［1-5］，本 研究即 優(yōu)化加 味圣愈湯的醇提工藝。處方中主要分為補氣和活血化瘀類中藥，因此本實驗選取補氣類中藥人參有效成分人參皂苷［6］， 以及活血化瘀類中藥白芷的有效成分歐前胡素、異歐前胡素為評價指標，結(jié)合干膏收率，進行工藝優(yōu)化。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 高 效 液 相 色 譜 儀， Agilent ChemStation 工 作 站，BP211D電 子 天 平 （德 國Sartorius公司） ， Sepax bio-C18色 譜 柱 （ 4.6mm ×250mm， 5μm） （ 美 國 Sepax Technologies公司）。 人 參 飲 片 （ 批 號 1206020）、 黃 芪 飲 片（批號 1301003）、 白芷飲片 （批號 1304003）、三棱飲片 （批號 1306016） 等， 均購于四川新荷花中藥飲片有限公司，經(jīng)過成都中醫(yī)藥大學盧先明教授鑒定， 符合 《中國藥典》 2010 年版規(guī)定。人參皂苷 Rg1對照品 （批號 120925）、 人參皂苷 Re對照品 （批號 121107）、 人參皂苷Rb1對照 品 （ 批 號 130129 ）、 歐 前 胡 素 對 照 品（批號 120903）、 異 歐 前 胡 素 對 照 品 （ 批 號121209）， 均由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供，五種對照品均供定量測定用，純度≥98%。分析甲醇，色譜乙腈，超純水等。

2 方法與結(jié)果

2.1 定量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素、異歐前胡素對照品適量， 置10 mL量瓶中， 加甲醇溶解，即得歐前胡素、異歐前胡素混合對照品溶液; 精密稱取人參皂苷 Rg1、Re、 Rb1對照品適量，置 10 mL量 瓶 中， 加 甲 醇 溶 解， 即 得 人 參 皂 苷Rg1、 Re、 Rb1混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密吸取各提取液5 mL， 水浴 揮 干， 用 甲 醇 溶 解 殘 渣 ，置 10 mL量瓶中，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備 按處方量稱取除人參外的各藥材飲片， 加8 倍量70%乙醇， 提取2 h，提取液按 “2.1.2”項下進行處理， 即得人參陰性樣品溶液;按處方量稱取除白芷外的各藥材飲片，加 8 倍量 70%乙醇， 提取2 h， 提取液按 “2.1.2”項下進行處理，即得白芷陰性樣品溶液。

2.1.4 色譜條件

2.1.4.1 人參皂苷 測 定 色 譜 條件 Sepax bio-C18色 譜 柱 （ 4.6 mm×250 mm， 5 μm） ， 流 動 相 為乙 腈 （ A） -水 （ B） ， 梯 度 洗 脫 ， 0 ～10 min，20%A;10 ～25 min， 20% ～27%A;25 ～45 min，27% ～40%A。 體 積 流 量 1.0 m l/min， 柱 溫25 ℃， 檢查波長 203 nm， 進樣體積 10 μL。 該色譜條件下，各檢測組分分離度良好，且無陰性干擾，見圖1。

2.1.4.2 歐前胡素、 異歐前胡素測定色譜條件［7］Sepax bio-C18色 譜 柱 （ 4.6 mm ×250 mm， 5 μm）， 甲醇-水 （70 ∶30） 為流動相， 體積流量1.0 mL/min， 柱 溫 30 ℃ ，檢測波長 251 nm，進 樣體積 10 μL。 該色譜條件下， 各檢測組分分離度良好， 且無陰性干擾， 見圖1。

圖 1 人參皂苷、 歐前胡素、 異歐前胡素的 HPLC圖Fig.1 HPLC fingerprint of ginsenosides， im peratorin and isoim peratorin

2.1.5 方法學考察

2.1.5.1 標準曲線的制備 精密吸取 “2.1.1”項下的混合對照品溶液 2、4、 6、 8、 10、 12 μL，進樣分析， 以進樣量 （μg） 對峰面積積分值進行線性回歸，結(jié)果表明各成分在相應(yīng)的范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好， 見表1。

表 1 歐前胡素、 異歐前胡素、 人參皂苷 Rg1、 Re、 Rb1、的線性范圍Tab.1 Linearities and ranges of ginsenosides， imperatorin and isoimperatorin

2.1.5.2 精密度試驗 精密吸取 “2.1.1”項下的混合對照品溶液 10 μL， 連續(xù)進樣 6 次， 記錄人參皂苷 Rg1、 Re、 Rb1、 歐前胡素、 異歐前胡素的峰面積， 其峰面積的 RSD分別為 0.56%、 0.67%。1.01%、 0.62%、 0.58%， 表明精密度良好。

2.1.5.3 重復性試驗 按處方比例稱取處方中各飲片 （平行稱取 6 份）， 分別加入 8 倍量 70%乙醇， 提取 2 h， 測得各樣品中人參皂苷 Rg1、 Re、Rb1、 歐前胡素、 異歐前胡素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為 0.05%、 0.03%、 0.14%、0.59%、 0.84%，RSD分 別 為 1.21%、 1.36%、 1.28%、1.13%、1.16%， 表明重復性良好。

2.1.5.4 穩(wěn)定性實驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL， 分別于 0、 2、 4、 6、 8、 12、 24、 36 h 進樣， 測定人參皂苷 Rg1、 Re、 Rb1、 歐前胡素、 異歐前胡素峰面積，其峰面積的 RSD分別為1.31%、1.26%、 2.02%、 1.12%、 1.16%， 表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5.5 加樣回收試驗 按處方比例稱取處方中各飲片 （平行稱取 6 份）， 精密加人參皂苷 Rg1、Re、 Rb1、 歐前胡素、 異歐前胡素對照品分別為7.45、14.89、 16.86、 2.67、 1.31 mg，加入 8 倍量 70%乙醇， 提取 2 h， 測定， 計算人參皂苷 Rg1、Re、 Rb1、 歐前胡素、 異歐前胡素的加樣回收率的平均 值 分 別 為 100.32%、 101.03%、 100.21%、99.16%、 99.98%， RSD分別為 1.66%、2.03%、1.32%、 1.14%、 1.23%。

2.2 干膏收率的測定 取各提取液 25 mL于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中， 水浴蒸干， 置105 ℃烘箱中干燥3 h， 取出， 冷卻至室溫， 稱定質(zhì)量并計算干膏收率。

2.3 單因素實驗選取因素及相關(guān)水平

2.3.1 乙醇體積分數(shù)對提取效果的影響 按處方比例稱取各中藥飲片， 分別以純水、 30%、 40%、50%、 60%、 70%、 80%、 90%乙醇為提取溶劑，加入 8 倍溶劑量， 提取兩次， 每次 1.5 h， 合并濾液， 測定各指標。 結(jié)果表明， 以 70%乙醇為溶劑時，人參皂苷及歐前胡素的提取效率最高;以80%乙醇為溶劑時， 異歐前胡素提取效率最高。 最后選取乙醇體積分數(shù)上限為 80%， 下限為 60%。

2.3.2 溶劑倍數(shù)對提取效率的影響 按處方比例稱取各中藥飲片， 分別加入 6、 8、 10、 12、 15、20 倍 70%乙醇溶液， 提取 2 次， 每次 1.5 h， 合并濾液，測定各指標。結(jié)果表明，各指標的提取效率隨提取溶劑量的升高而升高， 但溶劑量增大到12倍時，提取效率增大不明顯，因此選擇溶劑倍數(shù)的上限為12倍溶劑量， 下限為6倍溶劑量。

2.3.3 提取時間對提取效率的影響 按處方比例稱取各中藥飲片， 加 8 倍量 70%乙醇， 分別提取0.5、1、 1.5、 2、 3 h，合并濾液， 測定各指標。各指標的提取效率隨提取的時間增加而增加，但是當提取時間增加到2 h時，提取效率增加不明顯，因此選取提取時間的上限為 2.5 h， 下限為1.5 h。

2.3.4 提取次數(shù)對提取效率的影響 按處方比例稱取各中藥飲片， 加 8 倍量 70%乙醇， 分別提取1、 2、 3 次， 每次1.5 h， 合并濾液， 測定各指標。結(jié)果表明各指標均隨提取次數(shù)的增加而增加，但提取3次比提取2次增加不明顯，因此提取次數(shù)確定為2次。

2.4 星點實驗設(shè)計與結(jié)果 據(jù)單因素實驗結(jié)果，提取次數(shù)確定為 2 次， 選取乙醇體積分數(shù) （A）、提取時間 （B）、 溶劑倍數(shù) （C） 作為考察對象，采用 Design Expert7.0 統(tǒng)計分析軟件， 以人參皂苷Rg1、 Re、 Rb1、 歐前胡素、 異歐前胡素、干膏收率的總評 OD值為響應(yīng)值， 進行星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化實驗，選取最佳提取工藝參數(shù)。因素水平見表 2， 實驗安排及結(jié)果見表3。

表2 星點設(shè)計因素與水平Tab.2 Factors and levels

表3 星點實驗安排及結(jié)果Tab.3 Central com posite design and results

2.5 模型的建立 以總評 OD值對各因素進行多元線性回歸和二次項擬合，得多元線性方程:

Y=-1.191 57+9.402 35 ×10-3A+0.439 32B +0.017 443C， （r=0.680 7， P=0.016 6）;

二次項方程:

Y=-14.354 44+0.299 10A+3.137 10B+ 0.154 14C-4.797 67 ×10-3AB+1.507 99 ×10-4AC+ 8.776 48 ×10-4BC-2.010 39 ×10-3A2-0.592 46B2-8.278 05 ×10-3C2， （r=0.9733， P＜0.01）

從r值可知，二次項擬合方程復相關(guān)系數(shù)（r=0.973 3） 較高，該方程擬合度高， 可信度較大，預測性較好。選取二次項擬合方程為模型，固定3個自變量之一為中值， 以總評 OD為因變量，繪制效應(yīng)面三維圖， 見圖2。

圖2 三維效應(yīng)圖Fig.2 3D response sur face

基于建立的數(shù)學模型，對工藝進行最優(yōu)化設(shè)計， 得到最佳的工藝參數(shù)為:71.95%乙醇， 溶劑倍數(shù)為 10.09 倍， 提取時間為 2.36 h。 結(jié)合實際生產(chǎn)， 本實驗選取的最佳提取工藝為 72%乙醇， 溶劑倍數(shù)為 10 倍， 提取時間2.5 h。

2.6 驗證實驗 據(jù)最佳工藝條件， 稱取 5 倍原藥材量3 份， 分別加入10 倍量72%乙醇， 提取2 次，每次 2.5 h。 測定各指標， 結(jié)果與擬合方程預測的最大值相比較，見表4。

表 4 驗證實驗結(jié)果 （n=3）Tab.4 Validation test（ n=3）

預測值與實測值偏差較小，表明建立的數(shù)學模型預測性較好。因此，確定最佳的提取工藝為: 72%乙醇， 溶劑倍數(shù)為 10 倍， 提取 2 次， 每次2.5 h。

3 討論

中醫(yī)學認為黃褐斑病因病機與肝、脾、腎功能失調(diào)以有關(guān)［8-10］， 長期的精神壓力， 所思不遂致使氣機郁結(jié)， 肝郁氣滯， 血瘀于面［11］; 飲食或思慮傷脾，致使脾氣虛弱難以運化水谷精微，久則造成氣血不足不養(yǎng)于面;稟賦素虧，或由于房事不節(jié)，或孕產(chǎn)過 多， 致使腎中精 血 虧 虛， 肌膚失養(yǎng)［12］。氣血虧虛，氣滯血瘀，精血不能上榮于面是黃褐斑發(fā)生的基本病機［13］， 治療當以益氣養(yǎng)血、 活血化瘀為基本原則。該方以人參大補元氣，補益脾腎之氣，為君藥;黃芪健脾補中、升陽舉陷、托毒生肌，三棱破血行氣，白芷燥濕排膿，升陽明清氣，三藥共用為臣藥。君臣相配，意在益氣補血，活血理氣化瘀，托毒排膿生肌，以榮養(yǎng)面表肌膚。縱觀全方，以培補肺脾腎，益氣補血治其本，以活血化瘀、排毒生肌以治其標，標本兼治，以達到消除色斑，美白養(yǎng)顏的效果。

近年來， 星點設(shè)計-效應(yīng)面法在中藥提取工藝的優(yōu)化方面應(yīng)用廣泛，適宜于非線性模型擬合，精密度高， 預測性好［14］。 本實驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上， 利用星點設(shè)計-效應(yīng)面法進行提取工藝篩選，為處方中的有效成分的提取提供依據(jù)。本實驗以多個評價指標進行提取工藝篩選，能較為全面地反應(yīng)有效成分的提取效率，但每個指標優(yōu)選出的條件可能并不完全一致。為了能反應(yīng)總體效應(yīng)結(jié)果，本實驗采用 “歸一化”法， 對各指標結(jié)果進行 “歸一化” 處理， 計算出總評 OD值， 以總評 OD值為綜合評價指標，以得到綜合效應(yīng)較佳的提取工藝，且使實驗?zāi)Ｐ途哂懈玫念A測性。基于建立的數(shù)據(jù)模型，優(yōu)化出最佳的工藝參數(shù)為:71.95%乙醇， 溶劑倍數(shù)為 10.09 倍， 提取時間為 2.36 h。 該工藝的總評 OD值的預測值為 0.8901， 3 次驗證實驗的總評 OD值的平均值為 0.899 6， 偏差為 1.07%，結(jié)果表明采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法， 優(yōu)化加味圣愈湯的提取工藝，方法簡便，且預測性較好。但該結(jié)果為實驗室小試數(shù)據(jù)，有待放大實驗的進一步驗證。

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Extraction optim ization of Supp lemented Shengyu Decoction by central composite design-response surfacem ethod

YANG Xiu-mei， OU Xiao-qun， TAN Mao-lan， TANG Zhao-hui， LIWei-hong， HUANG Qin-wan*

（ Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

Supplemented Shengyu Decoction;extraction;central composite design;response surface

R284.2

:A

1001-1528（2014）12-2512-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.015

2013-12-04

四川省科技廳支撐計劃 （2012FZ0017）; 成都市科技局課題 （12DXYB310JH）

楊秀梅 （1988—）， 女， 碩士生， 主要從事中藥新制劑新技術(shù)的研究。 Tel:13568997942， E-mail:564004232@qq.com

*通信作者: 黃 勤 挽 （ 1979—） ， 男， 博 士， 副 教 授， 碩 士 生 導 師， 從 事 中 藥 炮 制 與 中 藥 制 劑 研 究。 Tel:13982199974， E-mail: 36190587@qq.com

日期:2014-06-23

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