霍山石斛 HPLC特征圖譜研究

魏 剛, 順慶生, 戴亞峰, 葉家宏, 李 濱, 黃月純, 何祥林, 楊明志

（1.廣州中醫藥大學, 廣東 廣州 510006； 2.上海健康職業技術學院, 上海 200237； 3.九仙尊霍山石斛股份有限公司, 安徽 六安 237003； 4.廣州中醫藥大學第一附屬醫院, 廣東 廣州 510405；5.安徽霍山長沖中藥材開發有限公司, 安徽 霍山 237266）； 6.中國中藥協會石斛專業委員會, 云南 昆明 650031）

霍山石斛 HPLC特征圖譜研究

魏 剛1, 順慶生2, 戴亞峰3, 葉家宏1, 李 濱3, 黃月純4*, 何祥林5, 楊明志6

（1.廣州中醫藥大學, 廣東 廣州 510006； 2.上海健康職業技術學院, 上海 200237； 3.九仙尊霍山石斛股份有限公司, 安徽 六安 237003； 4.廣州中醫藥大學第一附屬醫院, 廣東 廣州 510405；5.安徽霍山長沖中藥材開發有限公司, 安徽 霍山 237266）； 6.中國中藥協會石斛專業委員會, 云南 昆明 650031）

目的 建立霍山石斛 （ 霍山米斛） HPLC特征圖譜分析方法， 擬定黃酮類成分指標群。 方法 采用 Kromasil 100-5 C18色譜柱; 流動相為 乙 腈-0.1% 磷 酸 溶液 （ 梯 度 洗脫） ; 檢 測波 長 為 340 nm; 柱 溫 為 35 ℃; 體 積 流 量 1.0 mL/min。 結果 霍山石斛標示出 24 個黃酮類特征共有峰， 10 批樣品的相似度為 0.918 ～0.990， 相似度較高。 結論方法準確可靠，重復性好，本研究為霍山石斛的質量控制提供了方法依據。

霍山石斛;黃酮類成分;特征圖譜;高效液相色譜法

霍山石斛是石斛中最名貴的品種，也是最具代表性的品種。 清代趙學敏 《本草綱目拾遺》［1］（公元 1765 年， 清乾隆30年） 書中明確、 詳盡地闡釋了霍石斛， 其中記載:“ 《百草鏡》: 石斛近時有一種形短只寸許， 細如燈芯， 色青黃，咀之味甘，微有滑涎，系出六安州及穎州府霍山縣，名霍山石斛，最佳。其功長于清胃熱，惟胃腎有虛熱者宜之，虛而無火者忌用。……范瑤初云:霍山屬六安州。其地所產石斛名米心石斛，以形如累米，多節，類竹鞭，干之成團。 他產者不能米心， 多不成團也。” 因此霍山石斛又稱霍山米斛。

霍山米斛野生資源由于遭到大規模的破壞，少見真影，直到本世紀八十年代， 才確定了其拉丁學名:Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng。 其中鑒定標本就是由安徽霍山縣的何云峙先生所提供的。 2003 年包雪聲、 順慶生等出版 《霍山石斛》 一書， 兩位作者收集、 栽種、 觀察與鑒定的 （石斛） 種類至少涉及有 50 種; 同時認為:趙學敏、 趙學楷在 《本草綱目拾遺》 及 《百草鏡》 中所記述的霍石斛或霍山石斛，其指的植物性狀特征只能與霍山石斛 Dendrobium huoshanese C.Z.Tang et S.J.Cheng相互符合， 而不是指石斛屬其他種類植物［2］。

霍山石斛局限分布于安徽省霍山縣及鄰近地區，以其味甘、黏質厚之上乘品質成為石斛中的極品，備受歷代醫家推崇［3］， 但目前尚未列入中國藥典。 《 本草綱目拾遺》中有對霍山石斛產品加工及應用情況的明確記載。如 “彼土人以代茶茗” 的 “形曲不直” 的自然干燥產品， “有成毬 （球） 者……” 的人工卷曲加工產品， 而后者即為現代楓斗產品的前身［2］， 目前市場上的大量楓斗產品可能由此演變而來。由于霍山石斛獨特的生長環境要求，以及歷代的采挖和近代生態環境的改變，其野生資源日趨稀少，瀕臨滅絕［4］。 導致市場上充斥各種假冒偽劣 “霍石斛”、 “霍斗”、 “金霍斛”， 因此研究一種真偽鑒別的技術非常必要。

目前真正在市場上出售的霍山石斛成品極少，常用細莖石斛等加工冒充成霍山石斛［5-6］。 由于難以得到真正的米斛成品，有關米斛質量研究的報道更少。近年來霍山石斛人工栽培取得可喜進展，在安徽霍山縣已經開始初步量產，本實驗與霍山當地企業合作，采用人工栽培成功的米斛開展特征圖譜的研究，有利于規范霍山石斛的市場。課題組前期已開展了鐵皮石斛［7］、 齒瓣石斛［8］、 兜唇石斛［9］等特征指紋圖譜的研究，本次在確保霍山石斛來源正品的基礎上， 采用 HPLC特征圖譜的分析技術來建立栽培霍山石斛特征圖譜，為確保霍山石斛的質量提供依據，并初步比較了栽培品與野生品的差異。針對霍山地區常以銅皮石斛冒充霍山石斛的現狀，初步比較了霍山米斛與霍山產銅皮石斛特征圖譜差異。

1 儀器和試藥

四元泵、 柱溫箱、 二極管陣列檢測器和 Agilent1200 色譜工作站 （ Agilent 1200 高效液相 色 譜儀， 美國 Agilent公司） ;Sartorius BP 211D 分析 天 平 （ 塞 多 利 斯天 平 有 限 公司）;KQ-400 KPE超聲波清洗儀 （ 功率 500 W， 頻率 40 kHz， 昆山市超聲儀器有限公司）。 9 批栽培霍山石斛 （編號 S1 ～S9） 由九仙尊霍山石斛股份有限公司提供， 1 批栽培霍山石斛 （編號 S10） 由何祥林提供， 1 批野生霍山石斛 （編號 S11） 及 1 批霍山栽培細莖石斛 （編號 S12） 由安徽九仙尊霍山石斛股份有限公司提供。霍山石斛經順慶生教授鑒定系霍山石斛 Dendrobioum huoshanense C.Z.Tang et S.J.Cheng的 莖， 細 莖 石 斛 為 Dendrobium moniliforme（L.） Sw.的莖， 當地俗稱黃銅皮。 鮮品霍山石斛、 細莖石斛在60℃條件下減壓烘干， 備用。 乙腈為色譜純， 其他試劑為分析純。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 Kromasil 100-5 C18色 譜 柱 （ 250 mm×4.6 mm， 5 μm）; 流動相由乙腈 （A） -0.1%磷酸溶液 （B）組成， 梯度洗脫 （0 ～30 min， 13% →18% 乙 腈;30 ～55 min， 18%→27%乙腈， 55 ～60 min， 27%→35%乙腈） ; 檢測波長 340 nm; 柱溫 35 ℃; 體積流量 1.0mL/min。

2.2 供試品溶液 取霍山石斛粉末 （過四號篩） 1 g， 精密稱定， 加甲醇 50 mL， 回流提取 4 h， 取出， 放冷， 濾過，濾液減壓蒸干，殘渣加甲醇使之溶解， 置 2 m L量瓶中，再加甲醇稀釋至刻度，緩緩搖勻，即得。同法制備銅皮石斛的供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 精密吸取 5 μL同一供試品溶液， 連續進樣 6 次。 所得圖譜與對照模式的相似度均大于 0.99，顯示精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 精密吸取 5 μL同一供試品溶液， 分別在 0、 3、 6、 9、 12、 24 h 進樣。 所得圖譜與對照模式的相似度均大于 0.99， 顯示 24 h 內供試品溶液穩定性較好。

2.3.3 重復性試驗 取 6 份同一批樣品， 分別制備供試品溶液，進樣分析。所得圖譜與對照模式的相似度均大于0.99， 顯示重復性良好。

2.4 樣品檢測 精密吸收 5 μL供試品溶液， 同法進樣分析。

2.5 特征圖譜的建立和分析

2.5.1 確定共有峰 根據以上 10 批霍山石斛的樣品的分析結果， 其 HPLC色譜均有 24 個特征共有峰， 計算各特征共有峰的相對保留時間與相對峰面積，以峰5為參照峰（S） 計算， 結果見表 1。

表1 霍山石斛 HPLC特征圖譜

2.5.2 相似度分析 采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件 （2004A版） 進行， 以均值數法生成10批栽培霍山石斛特征圖譜。 樣品相似度比較結果見表2。 10 批樣品 HPLC特征圖譜重疊圖及共有模式見圖 1 ～2。野生霍山石斛 （見圖 3） 除個別峰與栽培品不一致外， 絕大多數峰與栽培品一致，但相對峰面積比值有差異，與栽培霍山石斛特征圖譜對照模式的相似度為 0.839。 銅皮石斛 （見圖4） 主要為兩個較大的特征峰， 與霍山石斛有明顯差異。

表2 霍山石斛 HPLC特征圖譜的相似度

圖 1 10 批霍山石斛 HPLC的特征圖譜重疊圖

圖2 霍山石斛 HPLC的特征圖譜對照模式

圖3 野生霍山石斛的 HPLC特征圖譜

圖4 霍山銅皮石斛 HPLC色譜圖

3 討論

石斛為名貴藥材， 《中國藥典》 2010 年版收載石斛為金釵石斛、 鼓槌石斛、 流蘇石斛［10］， 并將鐵皮石斛單列。霍山石斛是據考證石斛藥用歷史明確的四大石斛 （霍山石斛、鐵皮石斛、細莖石斛、金釵花）之一，且是其中最具代表性的品種。 我們的系列研究表明可以采用 HPLC特征指紋圖譜有效區分不同的石斛［7-9］。

本實 驗 比 較 了 Kromasil 100-5 C18柱 （ 250 mm × 4.6mm， 5 μm）、 ZOBAX SB Aq 柱 （250 mm×4.6mm，5 μm）、 ZORBAX SB C18柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） 的分離效果， 其中以 Kromasil 100-5 C18柱的 分 離 度較好; 考察不同柱溫 （25、 30、 35 和 40 ℃） 對分離效果的影響，結果以35℃效果最佳。 供試品溶液的制備比較了超聲處理及回流提取方法，對部分特征峰回流提取效果較好，而且濃縮處理較方便，確定采用回流方法。

本研究分析了10批栽培霍山石斛樣品， 各樣品均具有24個共有峰， 平均總共有峰面積百分比大于總峰面積的90%; 以均值法生成的共有模式為對照， 10 批樣品相似度大于 0.9， 表明栽培的霍山石斛具有比較穩定的 HPLC特征圖譜，從而意味其質量穩定。研究還分析了1批野生霍山石斛，與栽培霍山石斛特征圖譜對照模式為對照，相似度為 0.839， 主要特征峰基本一致， 提示栽培成功可行; 與栽培品相比，野生霍山石斛峰數較豐富，特征峰相對比值有差異， 野生品的峰 3、 峰 6 相對比值較大， 而峰 12、 峰17號則幾乎未檢出。

此外，實驗初步比較了1批霍山產銅皮石斛，結果發現與霍山石斛有非常明顯差異。課題組另對多批霍山產黃銅皮建立了特征圖譜，確實與米斛特征明顯不同。由于樣品量較少，野生與栽培霍山石斛特征圖譜規律性以及霍山石斛與銅皮石斛的差異性還有待進一步研究及證實。由于霍山石斛價格昂貴，暫無法大量制取獲得對照品，霍山石斛黃酮類成分的鑒別有待進一步利用 LC-MS/MS 等技術對主要色譜峰進行成分歸屬等研究。

［1］ 趙學敏.本草綱目拾遺［M］.北京: 人民衛生出版社，1957:83.

［2］ 包雪聲， 順慶生， 周根余， 等.霍山石斛［M］.上海: 上海科學技術文獻出版社， 2003:12-14.

［3］ 包雪聲， 順慶生， 陳立鉆.中國藥用石斛［M］.上海: 復旦大學出版社， 2001:75.

［4］ 劉守金， 武祖發，梁益敏， 等.霍山石斛的資源及生物學特牲［J］.中藥材， 2001， 24（10）::709-710.

［5］ 陳存武， 戴 軍，姚厚軍， 等.霍山石斛資源與鑒定研究進展［J］.現代中藥研究與實踐， 2013， 27（3）:84-87.

［ 6 ］ 劉志超.霍山石斛發展現狀與發展對策［J］.園藝與種苗，2012（10）:13-16

［ 7 ］ 魏 剛， 劉宏源， 黃月純， 等.鮮鐵皮石斛 HPLC特征圖譜研究［J］.中成藥， 2012， 34（9）:1739-1743.

［ 8 ］ 黃月純， 楊麗娥， 魏 剛， 等.齒瓣石斛 HPLC特征圖譜［ J］ .藥物分析雜志， 2012， 32（11） :2071-2076.

［ 9 ］ 楊麗娥， 黃月純， 魏 剛， 等.兜唇石斛 HPLC特征圖譜研究［J］.中藥新藥與臨床藥理， 2012， 23（5）:299-302.

［10］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010 年版一部［S］.北京: 中國醫藥科技出版社， 2010:85， 265.

:B

1001-1528（2014）12-2642-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.048

2014-06-03

魏 剛 （1969—）， 男， 研究員， 博士生導師， 研究方向: 中藥新藥研究與指紋圖譜分析。 Tel: （020） 39358519， E-mail: weigang021@163.com

*通信作者: 黃月純 （1968—）， 女， 主任中藥師， 碩士生導師， 研究方向: 中藥質量標準研究與指紋圖譜分析。 Tel: （020）36591378， E-mail:huangyuechun@163.com