慢性間歇低氧對小鼠骨密度和骨代謝的影響

朱再勝　黃卡特　鄭靖宇　戴爽　吳玲　杜曉紅　李劍敏

慢性間歇低氧對小鼠骨密度和骨代謝的影響

朱再勝黃卡特鄭靖宇戴爽吳玲杜曉紅李劍敏

【摘要】目的探討慢性間歇低氧（CIH）對骨密度（BMD）和骨代謝的影響。方法將16只12周齡C57BL/6雄性小鼠按隨機數(shù)字表法分為慢性間歇低氧組（CIH組）和正常對照組（CON組），每組8只。CON組小鼠在正常環(huán)境下飼養(yǎng)，CIH組小鼠在間歇低氧環(huán)境下飼養(yǎng)，低氧暴露時間為每日9:00～17:00，6d/周，共8周。于8周末取血，用ELISA法測定血清抗酒石酸酸性磷酸5b（TRACP-5b）、骨鈣素（OC）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平；取右側股骨檢測其BMD；取左側股骨觀察骨組織形態(tài)學改變，并分別采用免疫組化和real-time qPCR法檢測骨保護蛋白（OPG）和核因子-κβ受體活化因子配體（RANKL）和其mRNA表達。結果與CON組相比，CIH組小鼠BMD、血清OC水平及OPG/RANKL mRNA比值均明顯下降（P＜0.05或0.01），而血清TRACP-5b、IL-6和TNF-α水平、骨組織內RANKL和mRNA表達均明顯升高（P＜0.05或0.01）；但骨組織內OPG和mRNA表達差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；小鼠股骨干骺端骨小梁分布稀疏，變細及斷裂。血清IL-6水平與BMD呈負相關（P＜0.05），與骨組織RANKL mRNA呈正相關（P＜0.01）；血清TNF-α水平與BMD呈負相關（P＜0.01），與骨組織RANKL mRNA呈正相關（P＜0.05）。結論CIH能導致骨吸收增加、骨形成下降和BMD下降，與低氧以及CIH引起的IL-6、TNF-α水平升高導致RANKL升高有關。

【關鍵詞 】間歇低氧骨代謝骨密度骨保護蛋白核因子-κβ受體活化因子配體

骨質疏松癥是一種以骨量低下，骨微結構損壞，導致骨脆性增加，易發(fā)生以骨折為特征的全身性代謝性骨病。骨質疏松癥患者在日常活動中的輕微創(chuàng)傷往往就能引發(fā)骨折，產(chǎn)生致畸、致殘甚至死亡等嚴重后果。任何原因引起成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收偶聯(lián)的動態(tài)失平衡是導致骨再建的病理生理基礎，當骨吸收強于骨形成時，則出現(xiàn)骨質疏松癥。目前研究顯示高原環(huán)境持續(xù)低氧可使機體骨代謝異常、骨量減少、骨組織微結構破壞，導致骨密度（bone mineral density，BMD）下降，發(fā)生骨質疏松[1]。然而，諸如睡眠呼吸暫停綜合征、航空旅行和反復高海拔回到海平面所引起的慢性間歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）是否影響骨質代謝的失平衡，導致骨質疏松發(fā)生，目前國內外的研究結果并未達成共識[2-4]。筆者采用CIH小鼠模型，研究CIH對骨代謝、BMD、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及骨組織骨保護蛋白（OPG）、核因子-κβ受體活化因子配體（RANKL）表達的影響，同時探討CIH導致骨質疏松的相關機制，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1材料SPF級健康12周齡雄性C57BL/6小鼠16只,體重19.5～24.0g，平均（22.5±1.1）g；由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號:SYXK（浙）2010-0150。免疫組化試劑：OPG和RANKL兔抗小鼠多克隆抗體（一抗，武漢博士德生物工程有限公司）；realtime qPCR試劑盒（美國Invitrogen life technologies）；OPG、RANKL及內參GAPDH引物（上海康成生物工程有限公司）；骨鈣素（OC）、抗酒石酸酸性磷酸5b（TRACP-5b）、IL-6和TNF-α等ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2實驗分組適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為慢性間歇低氧組（CIH組）和正常對照組（CON組），每組8只。CON組置于正常環(huán)境飼養(yǎng)，CIH組置于常壓低氧艙中飼養(yǎng)，維持艙內氧積分數(shù)8%～11%，CO2濃度1%～3%[5]，低氧暴露時間為每日8h（9：00～17：00），6d/周，連續(xù)8周。兩組小鼠自由飲食，每周測量體重1次。

1.3標本采集在實驗8周末，斷頭處死小鼠，取血1～1.5ml，靜置、離心、分離血清，取血清置-80℃低溫保存待用。每組隨機取4只小鼠的左側股骨，采用中性福爾馬林液固定24h，取出后置20%EDTA溶液中4℃脫鈣，3d換液1次，直至大頭針能順利刺入骨組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋，用于組織形態(tài)學觀察；取其余4只小鼠的左側股骨，置-80℃保存用于real-time qPCR檢測。取所有小鼠的右側股骨，用浸有0.9%氯化鈉溶液的濕紗布包裹，-20℃低溫保存，測定BMD。

1.4檢測方法

1.4.1OC、TRACP-5b、IL-6和TNF-α檢測采用ELISA法，具體操作嚴格按照試劑盒的說明書。

1.4.2BMD測定取出-20℃保存的右側股骨，應用QDR-4500型骨密度儀小動物軟件（美國Hologic公司）程序掃描整段股骨的BMD，其重復測量的內在變異率在1.7%～2.0%。

1.4.3骨組織形態(tài)學觀察及OPG、RANKL表達強度取左側股骨石蠟包埋組織，采用連續(xù)間隔切片，厚度5μm，取1張行HE染色，光鏡下觀察骨組織結構；另各取5張分別行OPG、RANKL免疫組化染色，油鏡下觀察OPG、RANKL的表達變化。用PBS緩沖液取代一抗（濃度均為1：100）作為陰性對照。每張切片隨機取不重復5個視野，并在油鏡下（1 000倍）攝像。每個視野均進行陽性細胞百分比計分和著色強度記分[6]。結果判定方法如下：陽性細胞百分比記分：≤25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別記分為l、2、3、4分。著色強度記分：按陽性細胞著色（顏色）無、弱（淡黃）、中（棕黃）、強（棕褐）分別記分為0、1、2、3分。上述兩種記分結果相加，1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分中等陽性（++），6～7分為強陽性（+++）。兩組間OPG、RANKL表達強度的比較以陰性或陽性強度占切片的相對數(shù)表示。

1.4.4OPG、RANKL和GAPDH mRNA表達取-80℃保存的股骨標本，采用Trizol一步法提取總RNA。通過甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定所提取的RNA完整性，紫外吸收測定法鑒定RNA的純度，選擇完整性和純度均符合試驗要求的RNA樣品逆轉錄合成cDNA。采用real-time qPCR相對定量法，比較各組管家基因GAPDH以及目的基因的Ct值，采用2-ΔΔCt方法，得出mRNA的相對表達量。最終結果由PCR儀配套軟件自動計算。OPG上游引物5＇-CCTGGGACCAAAGTGAATGC-3＇，下游引物5＇-TCTGTGGTGAGGTTCGAGTGG-3＇，產(chǎn)物197bp；RANKL上游引物5＇-CATCGGGAAGCGTACCTACAG-3＇，下游引物5＇-GCTCCCTCCTTTCATCAGGTTAT-3＇，產(chǎn)物101bp；GAPDH（內參）上游引物5＇-GTTGTCTCCTGCGACTTCA-3＇，下游引物5＇-GCCCCTCCTGTTATTATGG3＇，產(chǎn)物293bp。

1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，等級強度的比較采用非參數(shù)秩和檢驗，IL-6、TNF-α和骨代謝指標的相關程度采用直線相關分析。

2　結果

2.1兩組小鼠股骨BMD及各指標的比較與CON組比較，CIH組股骨BMD、血清OC水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）；而血清IL-6、TNF-α及TRACP-5b水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），詳見表1。

表1　兩組小鼠股骨BMD及各指標的比較

2.2兩組小鼠骨組織形態(tài)學觀察HE染色，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)CON組小鼠股骨干骺端骨小梁飽滿、連續(xù)，骨小梁間隙分布均勻；CIH組小鼠股骨干骺端骨小梁變稀疏、變細，骨小梁間隙增寬，可見骨小梁斷裂、消失，詳見圖1。

圖1　兩組小鼠股骨遠端干骺端組織形態(tài)學觀察（A：CON組；B：CIH組；HE染色，×40）

2.3 兩組小鼠OPG、RANKL表達強度的比較OPG表達于軟骨細胞、成骨細胞胞質和胞核；RANKL表達于軟骨細胞、骨細胞、骨髓細胞質和胞核。與CON組比較，CIH組OPG表達強度的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而RANKL表達強陽性明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），詳見圖2、3和表2、3。

圖2　兩組小鼠股骨遠端干骺端OPG的表達（A：CON組；B：CIH組；免疫組化，×1 000）

圖3　兩組小鼠股骨遠端干骺端RANKL的表達（A：CON組；B：CIH組；免疫組化，×1 000）

2.4兩組小鼠骨組織OPG、RANKL mRNA表達的比較與CON組比較，CIH組骨組織RANKL mRNA表達明顯上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；OPG mRNA表達雖有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；而OPG/RANKL比值卻明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），詳見表4。

表2　兩組小鼠股骨組織OPG表達強度的比較

表3　兩組小鼠股骨組織RANKL表達強度的比較

表4　兩組小鼠骨組織OPG、RANKLmRNA表達的比較

2.5IL-6、TNF-α與骨代謝指標的相關性分析得到的r值見表5。

表5　IL-6、TNF-α與骨代謝指標的相關性分析（r值）

由表5可見，血清IL-6水平與BMD、血清OC水平均呈負相關，與骨組織RANKL mRNA水平呈正相關；血清TNF-α水平與BMD、血清OC水平均呈負相關，與血清TRACP-5b、RANKL mRNA水平均呈正相關。

3　討論

目前，在長期低氧導致骨質疏松的研究中，有學者發(fā)現(xiàn)長期低氧加快骨吸收過程，從而加速骨量丟失，導致骨質疏松的發(fā)生，形態(tài)學上表現(xiàn)為骨小梁體積下降，骨小梁斷裂、稀疏。然而，CIH對骨代謝和骨質的影響，不同的研究結果卻不盡相同[2-4]。本研究采用CIH小鼠模型，于實驗8周末分別檢測OC和TRACP-5b水平，發(fā)現(xiàn)血清中OC水平較CON組明顯降低，而TRACP-5b水平明顯升高。OC是骨基質的主要非膠原蛋白，由成骨細胞合成和分泌[7]，是骨轉換指標中反映成骨能力的重要指標之一，而TRACP-5b由破骨細胞和有活力的巨噬細胞所釋放的具有特異性和高敏感度的骨吸收指標[8-9]。OC升高，TRACP-5b降低則表示成骨能力增強，破骨能力降低，反之，則成骨能力降低，破骨能力增強。本研究中血清OC水平降低，TRACP-5b水平升高，說明實驗8周后CIH模型小鼠可能已經(jīng)存在成骨能力降低，破骨能力增強。進一步檢測股骨BMD和骨組織形態(tài)學的變化，發(fā)現(xiàn)CIH組小鼠的BMD明顯降低，形態(tài)學上出現(xiàn)骨小梁變稀疏、變細，骨小梁間隙增寬，骨小梁斷裂。因此，筆者認為實驗8周后CIH小鼠已經(jīng)出現(xiàn)骨質疏松的病理改變，與Conti等[2]研究結果相同。回顧相關文獻，不同學者對CIH對骨質代謝研究的結論不同，可能與其低氧暴露時間、方式和程度以及不同動物對象有關。

維持細胞的氧穩(wěn)態(tài)是細胞生命活動的前提，組織氧濃度必須被精確地控制在特定的波動范圍內。正常機體的氧濃度：動脈血約12%（95mmHg），靜脈血和毛細血管約5%（40mmHg）。當血液氧濃度下降，導致細胞在低氧條件下不能產(chǎn)生足夠的APT維持細胞正常功能，就會發(fā)生病理過程。低氧相關的疾病，如高原低氧和慢性呼吸道疾病總是伴隨低骨量[1，10]。既往的研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)低氧能誘導破骨細胞分化和抑制成骨細胞生成和分化[11-12]。本研究中發(fā)現(xiàn)CIH組骨吸收標志物TRACP-5b水平明顯升高，結果顯示CIH對破骨細胞的影響與持續(xù)低氧是一致的，筆者認為兩種低氧方式均能促進破骨細胞形成和功能。目前有許多研究探討低氧對成骨細胞的影響。在骨髓基質干細胞的研究中，發(fā)現(xiàn)低氧能刺激脂肪生成[13]，脂肪細胞和成骨細胞有共同的前體細胞，因此脂肪生成增多就伴隨成骨細胞生成減少。CIH也能減少成骨細胞的增殖、減少膠原的合成以及降低堿性磷酸酶的表達，進而導致骨生成減少[14]。然而，低氧對成骨細胞的影響是有爭議的，一些研究表明低氧促進成骨細胞的生長[15]，減少成骨細胞硬化蛋白的表達和促進Wnt信號通路來增強骨形成[16]。本研究發(fā)現(xiàn)CIH模型小鼠的血清OC水平下降，提示成骨能力下降，表明CIH抑制成骨細胞的生成和功能。

然而，CIH與高原低氧是不同的，CIH是間歇性低氧，間歇性低氧的低氧和復氧就如缺血再灌注，可以引起慢性炎癥狀態(tài)，如促炎細胞因子IL-6、TNF-α升高[3]。炎癥細胞因子活性的變化可能對骨骼系統(tǒng)具有重要作用的觀念已得到普遍認可。單核細胞和巨噬細胞分泌的IL-6、TNF-α等促炎細胞因子是最強的骨吸收刺激因子，它們對骨重建的調節(jié)作用基本相同，直接或間接地作用于破骨細胞前體細胞，使其分化為破骨細胞，發(fā)揮骨吸收的作用，尤其是在炎癥相關的病理性破骨細胞性骨吸收中具有重要作用。TNF-α可促進破骨細胞前體細胞的增殖和分化[17]，或間接通過對成骨細胞的作用而促進骨吸收。而且，TNF-α可抑制成骨細胞合成膠原[18]。IL-6也可直接促進破骨細胞祖細胞增殖，并增強破骨細胞活性[19]。本研究顯示升高的IL-6、TNF-α和降低的股骨BMD緊密相關，提示促炎細胞因子也參與了CIH小鼠低骨量的發(fā)生，是導致CIH小鼠骨量減少的重要因素。

OPG/RANK/RANKL是骨代謝和重建的重要調節(jié)因子。RANKL在骨吸收過程中扮演主要角色，RANKL異常升高將會引起破骨細胞數(shù)量增多和活性增強，繼而破壞骨形成和骨吸收平衡；OPG能競爭性結合RANKL，從而阻礙RANKL和RANK結合，抑制破骨細胞分化和成熟，阻止骨吸收[20-21]。國內外研究已經(jīng)證實OPG/ RANK/RANKL調節(jié)失衡會導致骨質疏松癥的發(fā)生和進展。既往的體外實驗發(fā)現(xiàn)，持續(xù)低氧抑制小鼠成骨細胞表達OPG，刺激RANKL表達，從而誘導成骨細胞介導破骨細胞的分化成熟[22-23]，增加骨吸收信號傳遞。但本研究發(fā)現(xiàn)CIH引起骨組織RANKL表達增加，而OPG表達無明顯差異，同時也發(fā)現(xiàn)血液IL-6和TNF-α水平與骨組織RANKL mRNA表達水平有明顯相關性。筆者認為體內研究結果與體外研究結果不相符，其原因可能為：IL-6和TNF-α等促炎細胞因子與OPG/RANK/ RANKL能相互作用有關[24-25]。

總之，CIH能導致骨吸收增加、骨形成下降和BMD下降，考慮與低氧以及CIH引起的IL-6、TNF-α水平升高導致RANKL表達升高有關。

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（本文編輯：嚴瑋雯）

收稿日期：（2014-06-25）

基金項目：溫州市科技局科研基金資助項目（Y20120038）

作者單位：325015溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年病科（朱再勝、杜曉紅），病理科（黃卡特、鄭靖宇、戴爽、吳玲、李劍敏）

通信作者：李劍敏，E-mail：wzyxyljmin@163.com

Effects of chronic intermittent hypoxia on bone mineral density and bone metabolism in mice

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of chronic intermittent hypoxia(CIH)on bone mineral density(BMD)and bone metabolism in mice.MethodsSixteen male C57BL/6 mice aged 12 weeks were randomly assigned into 2 groups:CON group(n=8)and CIH group(n=8).Mice in CIH group were exposed to hypoxic environment 8h×6d/week,while mice in CON group were exposed to normal environment.At the end of 8 weeks all animals were sacrificed.Serum levels of OC,TRACP-5b, IL-6 and TNF-αwere measured by ELISA;histopathology of bone tissue was observed by H.E staining and BMD examination was performed.The expression of OPG and RANKL protein and mRNA in bone tissue was detected by immunohistochemical staining and Real time-qPCR,respectively.ResultsHistopathology showed that in the metaphysis of distal femurs of CIH mice the bone trabecula became thinner and broken resulting in widening the intertrabecula space.Compared to CON group the BMD, serum OC level and ratio of OPG/RANKL were decreased significantly in the distal femurs of CIH group(P＜0.05 or 0.01),while the serum TRACP-5b,IL-6 and TNF-αlevel and the expression of RANKL protein and RANKL mRNA in bone were increased significantly(P＜0.05 or 0.01).But there were no significant differences in expression of OPG protein and OPG mRNA in bone between two groups(P＞0.05).The serum IL-6 and TNF-αlevels were negatively correlated with BMD(P＜0.05 or 0.01),and positively correlated with the expression of RANKL mRNA in bone tissue(P＜0.05 or 0.01).ConclusionThe results suggest that chronic intermittent hypoxia can increase bone resorption,decrease bone formation and bone mineral density,which are associated with up-regulation of IL-6 and TNF-αand higher RANKL level.

【Key words】Intermittent hypoxiaBone metabolismBone mineral densityOsteoprotegerinRANKL